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ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.37 No.3 pp.146-151
DOI : https://doi.org/10.13041/jpvm.2013.37.3.146

Lipopolysaccharide alleviates liver injury induced by thioacetamide in rats

Se-Ran Yang1,6,†, Jeong-Ran Park1,6, Eunjeong Kim1,6, Jungwon Yang1,6, Hanbyeol Lee1,6,
Seok-Ho Hong2,6, Seungkoo Lee3, InBum Seo4, Se-Min Ryu1, Sung-Joon Cho1,
Heung-Myong Woo5,6, Sung-Min Park1,6
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Republic of Korea
2Department of Pulmonary Medicine, School of Medicine, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Republic of Korea,
3Department of Pathology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Republic of Korea,
4Department of Clinical Diagnosis, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Republic of Korea,
5College of Veterinary Medicine, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Republic of Korea,
6Stem Cell Institute, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Republic of Korea
Received 22 August 2013, revised 15 September 2013, accepted 25 September 2013.

Abstract

Lipopolysaccharide (LPS) is the major of outer membrane of gram-negative bacteria and one of the most potent microbial initiators of inflammation. From the previous study showed that exposure to a low dose of LPS renders animals tolerant to a lethal dose of LPS, and protects against the toxicity of various chemicals. However, the effects of LPS treatment in thioacetamide (TA) - induced liver injury remain largely unknown. Liver injury caused by various toxic chemicals such as carbon tetrachloride, alcohol, dimethylnitrosamine. Here, we induced rat liver injury by intraperitoneal injection of TA, a representative hepatic fibrosis inducer. In this study, we investigated the effects of LPS in TA group, LPS group, LPS/TA group and vehicle control group on Sprague-Dawely rats (five rats for each group). All rats at the end of the experiment were sacrificed, and liver and serum were obtained. Serological analysis and hematoxylin and eosin staining showed that LPS/TA co-treatment was associated with decrease of aspartate aminotransferase (AST), alanine transaminase (ALT) and totalbilirubin and fibrosis than in TA-treated rats. RT-PCR showed that the levels of IL-6 and Cox2 mRNA were lower in the liver of LPS/TA-cotreated rats than in TA-treated rats. There were no significant differences ALT, ALP, AST, total-bilirubin, IL-6 and Cox2 between vehicle control and LPS-treated rats. These results imply that LPS/TA cotreatment partially alleviates the TA-induced liver injury of rats by reducing inflammatory response.

08_2013-44.pdf1.08MB

서 론

만성 간질환은 간섬유화, 간경화, 간암으로 구분되며, 간섬유화가 고도로 진행되었을 경우 간경화 및 간암으로 발전한다 [21]. 그러나 간섬유화에 대한 발생기전은 명확하게 알려져 있지 않고, 간섬유증 환자로부터 직접적으로 발생기전을 연구하는 것은 어렵기 때문에 다양한 화학물질 carbon tetrachloride (CCl4), etha- nol, dimethylnitrosamine 및 thioacetamide (TA)를 이용한 방법과 담도 결찰법의 외과적 방법을 이용한 연구가 진행되고 있다 [1, 4, 12, 22]. 여러 간손상 유발 동물모델이 알려져 있지만, 그 중에서 TA를 4달 동안 음수와 함께 섞어 제공하였을 경우 4개월 내 간경화가 유도되고, 6개월 내에 간암이 유도될 수 있다고 보고되었다 [10]. 또한 이렇게 장기간 TA를 투여하지 않고 단회 투여만으로도 aspartate amino-transferase (AST), alanine transaminase (ALT), IL-6와 같은 간손상 관련 지표가 증가하는 급성 간손상 모델을 유도할 수 있다는 것도 보고되어 있다 [2]. 특히 TA로 유도한 간손상 동물모델의 조직학적 특징이 CCl4로 유도한 간손상 동물모델보다 사람에서 보이는 간경화 형태와 더 유사하다고 알려져 있다 [14]. Lipopolysaccharide (LPS)는 내독소 (endotoxin)라고 부르며, 그람 음성균의 세포 외벽에 존재하며, 항체 생산, 폐혈증, 국소 염증과 같은 반응을 일으킨다. 고용량의 LPS는 동물이나 사람에서 여러 기관에 염증을 유발한다고 알려져 있다 [3]. 간에서의 LPS에 의한 작용기전은 많이 알려져 있지는 않으나, 간세포의 손상을 가져오거나 간경화 유발과 관련한다고 보고되었으며, 간경화나 간암이 있는 환자들은 보통보다 3~8배 많은 내독소 수치를 보여주는 것으로 조사되었다 [8, 19]. TA로 유도한 랫드의 간손상 모델에서 LPS를 투여하였을 때 간암 발생률이 더 증가하였으며, 조직학적으로도 더 악화된 경향을 보여주었다고 하며, 간암으로 유도된 동물모델에서는 LPS 투여 시 암세포의 세포사멸이 억제되었고, 간암을 더욱 악화시키는 결과를 보였다 [19, 23]. 한편 내독소에 대한 내성 (tolerance)은 치사량의 LPS에 의한 보호 작용이 있다고 알려져 있으며 [16], 이전의 보고에 따르면, 랫드에 저용량의 LPS 투여 후에 고용량의 LPS를 투여했을 때 염증반응이 줄어들고 폐혈증으로부터 예방될 수 있었고, LPS 전처리 후 acetaminophen나 CCl4로 간손상을 유도하였을 때, 그 손상 정도가 LPS를 전처리하지 않은 군에 비해 감소하는 것으로 조사되었다 [7, 16]. 그러나 아직까지 TA로 유도한 간손상 동물모델에서의 LPS 투여 시 미치는 영향에 대한 연구는 미비하여, 본 연구에서는 랫드를 이용하여 TA를 복강내 주사하여 간손상을 유도하였고, 저용량 LPS를 동시에 복강내로 주사하여 생화학적, 조직학적 연구를 통하여 TA에 의해 유도된 간손상이 완화될 수 있는지를 알아보았다.

재료 및 방법

시험물질 및 시약

실험에 사용된 LPS (Escherichia coli O55:B5)와 Thioacta- mide (TA)는 Sigma Chemical Co (MO, 미국)에서 구입하였고, Maxime RT PreMix Kit는 iNtRON Biotechnology (경기, 한국)에서 구입하였으며, Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) kit는 Bioneer (대전, 한국)로부터 구입하였다.

실험동물 및 실험기간

실험동물은 체중 160~170g 내외의 8주령 수컷 Sprague- Dawley 랫드를 두열 바이오텍으로부터 제공받았고, 7일 동안 환경에 적응시켰다. 실험군은 생리식염수 투여군 (Sham, n=5), LPS 투여군 (LPS, n=5), TA 투여군 (TA, n=5)과 LPS와 TA 투여군 (LPS+TA, n=5)으로 설정하고 Fig. 1과 같이 진행하였다. 간손상을 유발하기 위하여 thioacetamide (TA, Sigma, 국미)를 생리식 염수에 녹여 체중 kg당 200 mg을 0일과 4일에 복강 주사하였고 0, 2, 4일에는 LPS를 체중 kg당 1 mg 복강주사 하였다. 실험시작 후 7일이 되었을 때 졸레틸 (Zoletil)로 마취 후 혈액 채취 및 간을 적출하여 실험에 사용하였다. 모든 동물실험 및 관리는 강원대학교 동물실험 윤리위원회 윤리적 기준에 의거하여 시행되었다 (KW-121213-1).

Fig. 1. Experimental design for TA and LPS administration in rats. The rats were given LPS (1 ㎎/㎏) at day 0, 2, 4 and TA (200 ㎎/㎏) at day 0 and 4 by i.p. injection.

병리조직학적 관찰

부검을 통해 실험동물의 간 조직을 적출하여 10%의 포르말린을 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, 함수-탈수 처리를 거쳐 파라핀 블록을 제작하여 4 µm 두께의 미세절편을 만들어 슬라이드 글라스에 부착하였다. 제작된 슬라이드는 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 시행하여 광학현미경으로 관찰하였다 (Olympus BX53, Japan).

혈청학적 분석

실험동물은 졸레틸 (Zoletil)을 복강주사 후 개복하여 복대동맥에서 채혈하였다. 채혈된 혈액을 실온에서 1시간 방치 후 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 얻은 혈청을 통해 건식 생화학 분석기(FUJI DRI-CHEM 3500i, 일본)를 이용하여, aspartate aminotransferase (AST), alanine transaminase (ALT), total bilirubin (T-Bilirubin)과 alkaline phosphatase (ALP)를 측정하였다.

RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)

적출한 간조직은 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용 하여 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 Maxime RT PreMix Kit (iNtRON Biotechnology, 경기, 한국)을 사용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 Table 1에 제시한 프라이머를 이용해 RT-PCR kit (Bioneer, 대전 한국)를 사용하여 증폭시켰으며, 증폭된 RT-PCR 산물은 1% 아가로스겔에 loading하여 100 V 조건에서 30분 동안 전기영동을 통하여 확인하였다.

Table 1. The sequence of primers and optimal conditions for RT-PCR

통계처리

본 실험에 대한 실험결과는 평균과 표준편차 (mean±SD)로 나타내었으며, 각 군 간의 분석에 대한 유의성은 분산분석 (Ana- lysis of Variance, ANOVA) 및 Student’s T-test로 검증하였으며, p<0.05를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.

결 과

체중변화

실험 시작일과 부검 직전 증가된 체중을 측정하였다. 실험 7일간 체중 증가를 측정하였을 때 각 군별 체중 변화는 Fig. 2와 같이 Sham군 (232.3±9.3 g)에 비해 LPS 투여군 (217.6±7.8 g), TA 투여군 (219±12 g)과 TA와 LPS 투여군 (194.7±26 g)에서 감소하는 추세를 나타내었으나, 군간의 유의성은 나타나지 않았다.

Fig. 2. The changes in body weight after administration of saline-treated, TA-treated, LPS-treated or LPS plus TA treated rats. All values are expressed as mean±SD (n=5).

간조직의 형태학적 변화

간을 적출한 후 H&E 염색을 통하여 간조직을 관찰한 결과, 생리식염수를 투여한 Sham군의 간조직은 간문맥과 실질이 정상적인 구조를 유지하고 있었으며, 조직학적으로 정상적인 소견을 보여주었다. LPS 투여군은 간세포의 disarray의 형태가 관찰되었으나 섬유띠의 형태는 관찰되지 않았으며, TA 투여군은 염증성 변화가 보이며 간문맥과 중심정맥 혹은 문맥과 문맥을 잇는 섬유띠가 생성되는 전형적인 간경변이 관찰되었다. 반면, LPS와 TA 투여군은 염증성 변화가 줄어들고 섬유띠의 형태는 보이나, TA군에 비해 완화된 형태를 관찰할 수 있었다 (Fig. 3).

Fig. 3. Histopathologic analysis of rat liver. Histopathologic changes of rat liver in sham, TA-treated, LPS-treated or LPS plus TA treated rats for 7 days (H&E, ×40 and ×100). Sections showed normal histology of liver (sham), liver cord disarray (LPS), fibrosis (TA) but LPS plus TA- treated livers showed decrease of fibrosis compared with TA-treated liver. C : central vein, P : portal vein, Scale bar=100 ㎛.

혈청학적 분석

혈청 내에 있는 AST, ALT와 ALP는 간세포에 존재하는 효소이며, 간세포가 파괴되면 혈중으로 나와 그 혈중치가 높아지게 되므로 간세포 손상 정도를 측정하는데 활용된다 [20]. Total bili- rubin은 적혈구가 손상되어 만들어지는 내인성 노폐물로 수치가 높을수록 간에 이상이 있음을 의미한다. Fig. 4에서 보듯이 LPS 투여군은 Sham군과 유의적 차이가 없었으며, Sham군에 비해 TA 투여군에서 ALP와 Total bilirubin의 수치가 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면에 TA 처치군과 LPS와 TA를 동시에 처치한 군을 비교하였을 때 LPS와 TA를 동시에 처치한 군에서 TA 투여군에 비해 ALT, ALP, Total bilirubin이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).

Fig. 4. Serological analysis of liver enzymes in sham, TA-treated, LPS-treated or LPS plus TA treated rats. Aspartate aminotransferase (AST), alanine transaminase (ALT), total bilirubin (T-Bilirubin) and alanine transaminase (ALP) were measured as markers of hepatocellular injuries for 7 days. All values are expressed as mean±SD. * p<0.05.

간조직 내에서의 염증관련인자의 mRNA 발현

대표적인 염증매개 인자인 IL-6, Cox-2의 유전자 발현량을 RT- PCR을 이용하여 측정한 결과, IL-6와 Cox2의 발현이 TA 투여군에서 현저히 증가되었다. 이와 반면에 LPS와 TA 투여군에서 는 염증매개인자들의 발현이 TA 투여군에 비해 감소한 것을 확인하였다 (Fig. 5).

Fig. 5. Levels of (A) IL-6 and Cox2 mRNA expression on sham, TA-treated, LPS-treated or LPS plus TA treated rat liver for 7 days using RT-PCR. (B) The expression ratio was determined with the average intensity of bands in RT-PCR analysis. All values are expressed as mean±SD. * p<0.05. n=3.

고 찰

LPS는 그람 음성균의 세포벽을 구성하고, 동물이나 세포에 염증 반응을 일으켜 인체 내에서 방어기전을 실행시킨다고 알려져 있으며, 저용량의 내독소 노출로 인한 내독소 내성은 치사량의 LPS에 노출 시 이를 보호해 주는 효과가 있다고 하며, LPS 뿐만이 아니라 다른 화학물질의 반응으로부터 보호할 수 있는 것으로 알려져 있다 [15, 16]. LPS의 이러한 작용 중에서 본 실험에서는 랫드에서 TA에 의해 유도된 간손상 과정에서 저용량의 LPS와 동시 투여 시 TA에 의한 간손상을 LPS에 의해 완화될 수 있는지를 알아보기 위해 랫드를 이용해 동물실험을 수행하였다. 또한, 각 군에 따라 LPS와 TA 투여 후 일주일 뒤 간손상의 정도와 염증 관련 지표들의 변화를 확인하였다.

흔히 사용되는 간손상 동물 모델은 랫드에서 TA를 비롯한 여러 가지 화학물질에 의해 간손상을 유발하는 것이다. TA는 섬유화, 간세포 사멸 및 암을 유발시키며, 독성물질이 간세포에 미치는 영향과 그 대사과정을 규명하는데 대표물질로써 주로 사용되어 왔고, 랫드에서 TA에 의해 유도된 간손상은 사람 간 질환의 병변과 형태학적, 생화학적 특징이 유사한 것으로 보여진다 [14]. 본 실험에서는 200 mg/kg의 TA를 일주일 동안 2번 투여하였으며, TA로 유도된 간손상의 병리학적인 특징으로 TA 투여한 군에서 간세포의 섬유화가 관찰되었는데, 문맥 주위보다 간중심정맥 주위의 섬유화가 현저하였다. 이러한 병리적 소견은 기존에 보고된 TA에 의한 간손상 모델에서 보여지는 특징과 서로 일치하는 소견이었다 [13]. 그러나 LPS와 TA를 동시 투여한 그룹에서는 섬유화가 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 간세포의 섬유화를 초래하는 요인들이 많은데, 그 중에서 간성상세포의 활성이 중요하다고 한다 [11]. LPS의 TA에 의한 간손상의 보호효과에 간성상세포의 영향을 미칠 것으로 사료되며, 추후 이에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.

AST, ALT는 혈액에서 간기능 상태를 알아 볼 수 있는 지표로 간기능 저하시에 활성도가 증가한다 [18]. TA와 LPS를 동시 투여한 군이 TA 투여군에 비해 낮은 AST와 ALT를 보인 것은 LPS 투여로 인해 TA로 인한 간세포의 손상을 억제할 수 있음을 보여주는 것으로 생각된다. ALP는 신체 각 조직 중에 존재하며, 담즙 정체시에 담즙으로 배설되며, 담즙으로의 배설장애와 담관 내압이 증가할 경우 간에서 생성이 증가하여 혈중 ALP가 증가한다. 본 실험에서는 TA 처치한 군에 비해 LPS와 TA를 동시 처치한 군에서 ALP의 수치가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 이 또한 동시 처치한 LPS가 TA로 인한 간세포 손상을 억제하였음을 보여주는 것이다.

또한 간손상이 일어나면 IL-6, Cox2 와 같은 전구염증물질이 조직손상에 대한 면역반응으로 생성된다 [5]. TA 처치군에서 Sham 군과 LPS군에 비해 현저히 Cox2와 IL-6가 증가하는 것을 확인하였다. 전구염증매개 효소에는 cyclooxygenase (Cox)가 대표적인데, Cox2의 억제는 염증 증상을 감소할 수 있으며, Cox2는 정상 생리조건에서 거의 발현되지 않으나, 전구염증매개인자에 의해 유도되어 염증반응을 일으킨다 [9, 17]. IL-6는 염증 및 면역반응을 조절하고, 다양한 종류의 세포 증식을 자극하는 인자로서 세포의 손상기전에 관여한다 [6]. 간경화는 염증이 간 조직에 유발되어 간조직의 손상과 재생의 반복으로 점차 섬유화가 진행되는 병증이므로, 이 과정에서 염증을 억제하는 것이 중요하다. 본 연구에서 LPS와 TA의 동시투여가 염증매개효소 유전자의 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과, LPS의 TA 투여군이 TA 투여군에 비해 Cox2와 IL-6 mRNA 발현이 감소된 것을 알 수 있었다.

본 실험을 통해 LPS의 투여가 TA로 유도되는 간섬유화 및 염증반응을 완화시키며, 간섬유화 진행을 억제시키는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

감사의 글

본 연구는 농림수산식품부, 농림수산식품기술기획평가원 생명산업기술개발사업 (과제번호, 112008-5)과 (2013년도 강원대학교 학술연구조성비(과제번호, C1010268-01-01)로 수행되었습니다.

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