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ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.37 No.2 pp.73-80
DOI : https://doi.org/10.13041/jpvm.2013.37.2.73

Simultaneous analysis and monitoring of thirteen preservatives in cosmetics by liquid chromatography

Young Won Yoon1, †, Yong Jae Ryu1, 2, Gun Mook Yoon2, Bang Han Yun2, Bo Young Lee2, Pil Ki Min2, Ji Young Yun1, Sang Yoon Nam1, Beom Jun Lee1,‡
1College of Veterinary Medicine and Research Institute of Veterinary Medicine, ChungBuk National University, Cheongju 361-763, Republic of Korea
2Food & Drug Analysis Section, Chungbuk Health & Enviro㎚ent Research Institute, Osong 363-951, Republic of Korea
Received 1 June 2013, revised 19 June 2013, accepted 22 June 2013.

Abstract

The content of 13 preservatives was investigated for 107 sold in retail markets. A simultaneously analytical methodof liquid chromatography (LC) for the preservatives in cosmetics was developed using an AcQuityTM Ultra Performance LCSystem (Waters), BEH C18 column (150 mm✕2.1 mm, 1.7 ㎛) and Photo Diode Array (PDA) detector (λ; 220 ㎚ forquantitative analysis, λ; 190~400 ㎚ for qualitative analysis). The developed instrumental method was validated using limitof detection (LOD), limit of quantification (LOQ), precision, accuracy, and linearity of standard curves. LOD and LOQ werelower than 0.23 ㎎/ℓ and 0.75 ㎎/ℓ, respectively. When standard compounds were analyzed seven times consecutively atthe LOQ level, precision and accuracy were lower than 2.49% and 2.04%, respectively. Good linear relationships (R2≥0.9998)were obtained for all compounds. Recoveries ranged between 96.03% and 102.61% and the overall variability was below 3%(RSD). The type of cosmetics showing the lowest detection rate of target compounds was sunscreen lotion, with a detectionrate of 42.9%, followed by baby lotions and mask packs with the same detection rate at 69.2%. At least one of the targetpreservatives was detected in 82.4% of creams, 93.3% of skin toners, 95.2% of lotions, and 92.9% of body lotions. Overall,79.4% of all samples contained at least one of the target compounds. The most frequently detected compound wasphenoxyethanol. Methyl and propyl paraben also had a higher detection rate than the others, except phenoxyethanol. Althoughthe target preservatives in cosmetics sold in retail markets were detected by the simultaneous analysis of LC, the contentof the detected preservatives was within the maximum allowed amount established by the Korean FDA.

03 04 (20)윤영원_가편집doi+1교+가제본.pdf486.7KB

서 론

 화장품은 건강한 피부상태의 균형을 깨는 내·외부의 원인을 조절하여 건강하고 아름다운 피부상태를 유지하기 위한 목적으로 태어나면서 부터 평생을 사용하게 되는 일상용품이다. 그것은 대부분 인체에 영향이 경미한 화학물질과 천연에서 유래한 성분들을 원료로 하여 만들어 진다. 그러나 원료성분의 종류에 따라서 자극성 또는 알러지성 피부염 등과 같은 부작용을 일으킬 수 있고, 이는 소비자들이 화장품을 사용할 때 느끼는 불만 중 매우 높은 비율을 차지하고 있다 [14].

 일정량 이상은 사용할 수 없도록 배합한도가 지정되어 있는 보존제는 화장품 사용에 따른 부작용의 주요 원인으로 알려져있다[1]. 화장품은 대부분의 경우 개봉 후 장기간에 걸쳐 사용되고, 그것의 기본 배합성분 중 글리세린과 솔비톨 등은 미생물의 탄소원으로, 아미노산 유도체와 단백질 등은 미생물의 질소원으로 작용하여 미생물의 번식이 용이한 환경을 이루게 된다 [3, 19]. 미생물의 번식과 그것의 대사산물은 화장품의 pH 및 색 등 화장품 고유의 성질을 변질시킬 수 있고[11, 17], 결과적으로 제품의 품질 저하와 인체에서의 부작용이 야기될 수 있다. 이와 같이 미생물에 의한 부패를 방지하고 그 품질을 유지하기 위하여 화장품에서 보존제의 사용이 불가피하다. 화장품에서 보존제는 일반적으로 그 효과를 높이기 위하여 2종 이상이 혼용되고 있고 [5, 6, 15], 현재 우리나라는 유럽 (57종), 일본 (48종)보다 많은 59종의 보존제가 허가되어 있다 [16].

 살균·보존제는 반복 노출 시 세포 독성 및 접촉성 알레르기를 유발하는 것으로 알려져 있다 [7, 12, 21]. 특히 파라벤류(parabens)는 그것의 에스트로겐 효과에 대한 연구들이 보고되면서 사람에 대한 안전성 문제가 제기되었다 [20]. 일련의 연구결과에 따르면, 유방암 세포에서 파라벤의 농도가 정상인들에 비해 월등히 높게 검출되었고 [4, 8], 이러한 이유로 파라벤과 유방암과의 관련성이 제시되었다[9]. 또한 파라벤은 항안드로겐성질을 갖고 있어 정자의 미토콘드리아에서의 에너지생산과 수정기능을 방해하여 수컷생식계의 기능을 억제하는것으로 알려져 있다 [18, 23]. 그 밖에 페녹시에탄올 (phenoxyethanol), 벤조산 (benzoic acid), 소르빈산 (sorbic acid), 클로르페네신 (chlorphenesin) 그리고 벤질 알콜 (benzyl alcohol) 등과 같은 보존제가 파라벤류와 혼용되고 있고, 이들 역시 고농도로 반복 노출 시 피부 괴사와 유전 독성을 나타낼 수 있다고 보고 되고 있다 [7, 21].

 이들 보존제는 화학적으로 안정하고 항균성이 우수하여 화장품에서 뿐만 아니라, 식품, 의약품등에서도 미생물의 오염을 방지하기 위한 목적으로 광범위하게사용되고있다. 그러나 식품의 경우, 일부 식품유형에서만 제한적으로 특정 성분이 허용되어 있고, 사용된 보존제의 성분명뿐만 아니라, 그것의 함유량도 제품에 표기하도록 하고 있어 소비자의 안전한 선택이 충분히 보장되고 있는데 반해, 화장품의 경우 용도나 대상에 따른 배합 한도의 차이를 두고 있지 않고, 사용된 성분의 함량 또한 제품에 표기하도록 하고 있지 않아 그것의 함유량을 소비자가 알 수 없는 실정이다. 또한 효능과 안전성에 따라 전문가에 의해 피동적으로 선택되어 안전한 사용이 보장될 수 있는 의약품과 달리, 화장품의 경우 소비자의 자율적인 선택권이 보장되어 있어 자신에게 맞지 않는 성분을 다량 함유한 제품의 사용으로 인한 부작용의 가능성이 높다. 이와 같은 이유로 화장품의 안전성을 충분히 확보하는것이 중요하고, 이를 위해 화장품 사용시 부작용을 유발하는 주요 원인물질로 지목되는 보존제 성분의 함유 여부 및 사용된 함량에 대한 꾸준한 모니터링이 필요하다.

 따라서 본 조사 연구에서는 파라벤류 (methyl-, ethyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, isobutyl paraben) 6종을 포함하여 벤질 알콜 (benzyl alcohol), 페녹시에탄올 (phenoxyethanol), 소르빈산 (sorbic acid), 벤조산 (benzoic acid), 클로르페네신(chlorphenesin), 디히드로아세트산 (dehydroacetic acid), 살리실산 (salicylic acid) 등 총 13종의 보존제 성분을 선정하여 액체 크로마토그램으로 동시분석할 수 있는 조건을 정립하였고, 화장수, 로션, 바디 로션, 크림, 어린이용 로션, 자외선 차단제, 마스크 팩 등 일곱 가지 유형의 화장품에 대하여 제품 유형별 보존제 사용 현황과 보존제 성분별 사용 실태를 조사하였다.

재료 및 방법

조사대상 화장품

 실험대상 시료는 화장수, 로션, 크림, 바디 로션, 어린이용 로션, 자외선 차단제, 마스크 팩 등 7제형으로 분류하여 화장수 15종, 로션 21종, 크림 17종, 바디로션 14종, 어린이용 로션 13종, 자외선차단제 14종, 마스크 팩13종 등총 107종의 제품을 대형마트에서 구입하였다.

표준물질 및 시약

 본 연구에서 표준물질로 사용된 메틸파라벤 (methyl paraben: MP), 에틸파라벤(ethyl paraben: EP), 프로필파라벤(propyl paraben: PP), 이소프로필파라벤 (isopropyl paraben: IPP), 부틸파라벤 (butyl paraben: BP), 이소부틸파라벤 (isobutyl paraben: IBP)은 Wako사 (Japan)로부터 구입하였고, 벤질알콜 (benzyl alcohol: BA), 페녹시에탄올 (phenoxyethanol: PE), 소르빈산 (sorbic acid: S), 벤조산 (benzoic acid: B), 클로르페네신 (chlorphenesin: CPS), 디히드로아세트산(dehydroacetic acid: DHA), 살리실산 (salicylic acid: SA)과 내부 표준물질인 아세트아미노펜 (acetaminophen: ISTD)은 Sigma-Aldrich사에서 구입하였다. 시료 및 표준품에 대한 용매로 쓰인 아세토니트릴 (acetonitrile)은 Merk 사 (Germany)의 HPLC급 고순도 용매를 사용하였고, 기기 분석 시 이동상에 첨가한 인산(phosphoric acid)은 Burdick & Jackson 사 (USA)의 시약을 사용하였다.

실험 기기

 실험에사용된 3차 증류수는 Millipore 사의 Milli-Q 장비를 사용하여 얻었고, 측량은 Mettler-Toledo 사의 XP204 모델을 이용하였다. 시료로부터 보존제 성분을 추출해내기 위한 초음파기기는 Elma 사의 Elamasonic-P를 사용하였고, 추출 용매의 여과는 Whatman 0.2 ㎛ PVDF Syringe Filter를 사용하였다. 크로마토그래피 분석은 Waters 사 (USA)의 AcQuityTM Ultra Performance LC (UPLC) System을 사용하였다.

내부 표준용액의 조제

 아세트아미노펜 (acetaminophen)을 추출용매인 1% 인산(phosphoric acid)을 함유한 50% 아세토니트릴 (acetonitrile)에 녹여 5,000 ㎎/ℓ의 농도가 되도록 하였다.

혼합 표준용액의 조제

 표준원액은 각각의 보존제표준품을 추출용매에 녹여 클로르페네신의 경우, 1,000 ㎎/ℓ, 나머지 성분들은 약 4,000 ㎎/ℓ의 농도로 제조하였다. 13종 보존제 혼합 표준용액은 파라벤 6종과 벤질 알콜, 페녹시에탄올의 경우 300 ㎎/ℓ, 디히드로아세트산과소르빈산은 180 ㎎/ℓ, 벤조산과 살리실산은 150 ㎎/ℓ 그리고 클로르페네신은 90 ㎎/ℓ의 농도로 제작하였다. 정량분석을 위한 검량선은 내부 표준물질은 100 ㎎/ℓ, 보존제 표준성분의 경우 혼합 표준용액의 1/20, 1/10, 2/10, 4/10, 6/10, 8/10의 농도로 6단계 희석한 것을 분석하여 작성하였다.

시료 전처리

 50 ㎖ 용량플라스크에 시료 1 g을 정밀히 달아 취하고, 내부표준용액 1 ㎖와 추출용매를 넣어 50 ㎖가 되도록 한 후, 약 40분간 초음파로 추출하였다. 이후 추출용매를0.2 ㎛멤브레인 필터로 여과하였고, 이를 최종 시험용액으로 하였다.

액체크로마토그래피 분석

 액체크로마토그래피 분석은 Table 1의 조건으로 수행하였다. 220 ㎚ 파장에서 분석하여얻은 크로마토그래피 결과로 정량하였고, 검출된 성분의 경우 190 ㎚에서 400 ㎚ 파장 사이에서 추출한 표준물질의 스펙트럼과 시료의 스펙트럼을 비교하여 정성하였다.

Table 1 Instrumental conditions for the determination of the preservatives

회수율 실험 및 기기 분석조건 검증

 회수율 실험은 대상 시료 중 보존제 성분이 검출되지 않은 크림제형의 시료를 선정하여 실시하였다. 검체 1 g을 취한 후, 각각의 보존제 성분이 최대 배합허용 농도의 50%, 100%, 125%의 농도가 되도록 배합하였고, 이후 과정은 시료 전처리 과정과 동일하게 진행하였다.

 기기 분석조건을 검증하기 위하여 정량 한계 (limit of quantification: LOQ)와 검출한계(limit of detection: LOD) 농도를 설정하였고, 정량 한계 농도의 혼합 표준용액을 연속적으로7회 분석하였을 때의 피크 면적 비율에 대한 % RSD(relative standard deviation)를 구하여 분석의 재현성과 정확성을 확인하였다. 검량선의 직선성에 대한 검증은 정량 한계 농도를 포함하여 그것의 20배 농도 사이에서 5개 농도의 표준용액을 분석하여 진행하였다.

결과 및 고찰

정량 및 검출 한계 농도

 기기 분석조건의 검증을위해 분석의 반복정밀도 (precision)와 정확도 (accuracy)를 확보할 수 있는 최저 농도 즉, 정량 및 검출 한계 농도를 설정하였다. 13종 보존제 성분을 배합 허용한도 농도의 약 1/600의 농도로 제작한 혼합 표준 용액을 내부표준물질법으로 분석했을때의 크로마토그램은 Fig. 1과 같고, 그것으로부터 분석기기의 데이터 분석프로그램(Empower 2) 상에서 신호대비 잡음비율(S/N, signal to noise)이 10이되는 농도를 예상정량 한계농도로 설정하였다. 이후 예상 정량한계농도를 포함하여 그것의 10배 농도사이에서 3개 농도의 혼합표준용액을 제작하였고, 이를 분석하여 얻은 검량선의 기울기(S)와 예상 정량 한계 농도를 7회 연속 분석하여 얻은 피크 면적 비율의 표준편차(δ)로International conference harmonisation (ICH) validation guideline [13]에 따라 정량 한계 (10δ×S-1)와 검출 한계 (3.3δ×S-1)를 구하였다. 이렇게 얻은 정량 한계 및 검출 한계 농도를 Table 2에 나타내었다. 13종 보존제의 검출 한계 농도는 0.02~0.23 ㎎/ℓ, 정량 한계 농도의 경우 0.08~0.75 ㎎/ℓ의 범위에서 설정되었고, 이때의 반복정밀도는 2.49% 이하, 정확도의 경우 2.04% 이하로 매우안정적이었다. 이러한 결과로 수립된 분석조건으로 시료 전처리과정의 희석배수를 고려한  최대 배합허용 농도를 충분히 안정적으로 분석할 수 있다.

Table 2 Validation values of target preservatives in cosmetics

Fig. 1. Chromatogram of target preservatives including internal standard in liquid chromatography. The concentrations of the analy- sed target preservatives were around 1/600 of the maximum allowed concentration laid down by KFDA. The concentration of internal standard was 100 ㎎/ℓ. ISTD: internal standard (acetaminophen); BA: benzyl alcohol; PE: phenoxyethanol; S: sorbic acid; B: benzoic acid; MP: methyl paraben; CPS: chlorphenesin; DHA: dehydroacetic acid; SA: salicylic acid; EP: ethyl paraben; IPP: isopropyl paraben; PP: propyl paraben; IBP: isobutyl paraben; BP: butyl paraben.

직선성과 회수율

 검량선의 직선성을 평가하기 위하여 각 보존제 성분을 정량 한계 농도를포함한5개농도(0.08~22.50 ㎎/ℓ)의 혼합표준품으로 제작하여 분석하였고, 내부 표준물질법에 의해 정량하였다. 그로부터 얻은 상관관계계수(R2)의 값은 Table 3에서 보는 바와 같이 모든 성분에서 0.9998 이상으로 강한 직선성을 보여 주었다. 회수율 평가는 보존제가 검출되지 않은 크림제형 시료에 화장품 원료기준 고시에서 정한 배합 허용 한도 농도의 50%, 100%, 125%가 되도록 각 보존제 성분을 첨가하여 분석하였고, 역시 내부 표준물질법으로 정량하였다. 3개의 농도에서 진행한 회수율 실험의 결과는 평균 96.03~102.61%로 전반적으로 양호하였고, %RSD 역시 3% 이내로 일관성 있는 결과를 보여주었다.

Table 3 Linearity and recovery test of preservatives in liquid chromatography

화장품 중 보존제 성분 모니터링

 대형마트에서 소비자가쉽게 구입할 수 있는화장품을 7가지 유형으로 분류하여 화장수 15종, 로션 21종, 크림 17종, 바디로션 14종, 어린이용 로션 13종, 자외선 차단제 14종, 마스크팩 13종 등 총 107종을 대상으로 파라벤류를 포함한 13종 보존제 성분을 분석하였다. 화장품의 유형별로 대상 보존제 성분 중 1종 이상의 성분이 검출된 경우는 Fig. 2에서 보는 바와 같이 화장수 93.3%, 로션 95.2%, 크림 82.4%, 바디 로션 92.9%, 어린이용 로션 69.2%, 자외선 차단제 42.9%, 마스크 팩69.2%로 나타났고, 전체 107건 중 79.4%인 85건에서 본 조사연구의 대상보존제성분이 검출되었다. 그동안 화장품에서 방부효과를 갖는 천연물질에 대한 연구가 많이 진행되어 왔지만, 아직 대부분의 화장품에서 여전히 화학보존제가 널리 쓰이고 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 2008년 시행된 전 성분 표시제도에 따라 검출된 성분이 제품에 모두 표시되어 있었으며, Hwang 등 [12]이 2009년 실시한 연구에서 일부국산 화장품에서 검출된 보존제 성분이 제품에 표시되지 않았다고 보고한 결과와 비교해 볼때 현재 전 성분 표시제도가 시행 초기보다 잘 준수되고 있음을 알 수 있었다.

Fig. 2. Detection rate of target preservatives according to types of cosmetics. The target preservatives were detected over 90% in skin toners, lotions, and body lotions.

 보존제성분별 검출빈도는 Fig. 3에서 보는 것처럼 1종 이상의 대상 보존제가 검출된 시료 85건 중, 페녹시에탄올과 메틸파라벤이각각 62.4%의 검출률로 가장 높았고, 프로필파라벤이 37.6%의 검출률을 보였다. 그외, 에틸파라벤11.8%, 부틸파라벤 10.6%, 벤조산 7.1%, 클로르페네신과 살리실산이 각각 4.7%, 디히드로아세트산 3.5%, 벤질 알콜 2.4%의 검출률을 보였고, 소르빈산, 이소프로필 파라벤, 이소부틸 파라벤은 검출되지 않았다. 가장 높은 검출률을 보인 페녹시에탄올은 파라벤류 보존제보다 세포 독성이 낮은 보존제로 알려져 있고 [14], 방부효과가 좋아 화장품에서 파라벤류를 대체할 보존제로 알려져있다. 1차 피부자극도는 다른 파라벤류 보존제 보다 높지만 화장품의 지용성 성분의 극성을 조절함으로써 페녹시에탄올의 유수분배를 조절하여 피부흡수도를 낮추어 피부자극성을 감소시킬 수 있다고 보고되고 있다[14]. 내분비계에 영향을 줄 수 있고, 보다 강한 세포 독성을 갖는 파라벤류의 사용을 줄이고, 상대적으로 독성이 약한 페녹시에탄올을 사용함으로써 인체에 대한 안전성 과제품의 방부력을 동시에 확보하려는 것으로 보인다. 파라벤은 단독으로 사용하는 것보다 2종 이상 사용할 때 더 활성적인데, 에스테르그룹의 사슬길이가 길어질수록 살균 활성은 증가하며, 동시에 내분비 독성도 증가하는 것으로 알려져 있다 [2, 10]. 본 연구에서 파라벤류 중 가장 높은 검출빈도를 보인것은 메틸파라벤이었고, 프로필파라벤이 그 뒤를 이었다. 이는 부틸파라 벤과 같이 방부력은 좋지만, 세포 독성이 상대적으로 강한 성분의 사용을 최대한 피하고, 대신 메틸 파라벤과 같이 파라벤류 중에서 상대적으로 내분비 독성이 적은 성분을 주로 사용하면서 부족한 방부력은 프로필 파라벤을 혼용함으로써 확보하려는 것으로 사료된다.

Fig. 3. Detection rate of each target preservative compounds. Phenoxyethanol and methyl paraben showed the highest detection rate (62.4%). And propyl paraben was the compound that is most often used with methyl paraben to boost its effect among the other parabens with the detection rate of 37.6%. BA: benzyl alcohol; PE: phenoxyethanol; S: sorbic acid; B: benzoic acid; DHA: dehydroacetic acid; CPS: chlorphenesin; SA: salicylic acid; MP: methyl paraben; EP: ethyl paraben; IPP: isopropyl paraben; PP: propyl paraben; IBP: isobutyl paraben; BP: butyl paraben.

 검출된 보존제의 검출 함량은 벤질 알콜 (BA) 0.19~0.27%, 페녹시 에탄올 (PE) 0.02~0.66%, 벤조산 (B) 0.02~0.19%, 디히드로아세트산 (DHA) 0.07~0.11%, 클로르페네신 (CPS) 0.08~0.19%, 살리실산 (SA) 0.03~0.43%, 메틸 파라벤 (MP) 0.02~0.29%, 에틸 파라벤 (EP) 0.04~0.10%, 프로필 파라벤(PP) 0.02~0.20%, 부틸 파라벤 (BP) 0.04~0.09% 그리고 파라벤류의 합으로써 0.02~0.47%로 나타났고, 소르빈산 (S)과 이소부틸 파라벤 (IBP), 이소프로필 파라벤 (IPP)은 검출되지 않았다 (Table 4). 검출된 성분의 함량은 화장품 원료 지정에 관한규정(2010)에 지정된 배합 한도기준을 초과한 제품은 없었다. 그러나 2010년 유럽 소비자 안전성 과학위원회 (SCCS)는 화장품의 안전한 사용을 위해서 전체 파라벤류의 배합허용기준을 0.19% 이하로 낮출 것을 제안하였고 [22], 이번 연구에서 검출된 파라벤류의 함량은 이보다 높은 수준이다. 따라서 앞으로 국내에서도 파라벤류의 안전성에 대한 검증작업과 배합 허용기준에 대한 재고가 있어야 할 것으로 사료된다.

Table 4 Content of detected target preservative compounds

감사의 글

 본 연구는 2011년도충북대학교 학술연구지원사업의 연구비지원에 의해 연구되었음.

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