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ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.37 No.2 pp.81-86
DOI : https://doi.org/10.13041/jpvm.2013.37.2.81

Effect of sodium silicate on immune activity and safety in mice

Beom Jun Lee1, †, Ho Yoen Roh1, Ja Kyung Seol1, Ja-Seon Yoon1, Ji Young Yun1, Dang-Young Kim1, Young Won Yun1, Sang Yoon Nam1, Jae-Hwang Jeong2, Jong-Soo Kim1, ‡
1College of Veterinary Medicine and Research Institute of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Cheongju 361-763, Republic of Korea
2Department of Biotechnology and Biomedicine, Chungbuk Province College, Okcheon 373-807, Republic of Korea
Received 1 June 2013, revised 19 June 2013, accepted 22 June 2013.

Abstract

Sodium silicate (SS, Na2SiO3) is known as water glass or liquid glass. It possesses a number of biological activities,especially in improvement of cell growth. However, there were few reports on effects of the SS on an immune system havebeen reported so far. In this study, we investigated the immunostimulant effects of SS in mice. A total of 20 male ICR mice(eight-week-old) were divided into four groups (five mice for each group), and this experiment was duplicated. Animals werefed with the tap water containing 0%, 1%, 2%, and 3% sodium silicate solution for two weeks. After the animals had beensacrificed, spleen, thymus, and serum were obtained. Complete blood cell (CBC) counts and white blood cell (WBC) differentialcounts in blood have been performed using an automatic hematology analyzer. Cytokines (IL-2, IL-4, INF-γ, TNF-α)levels in spleen, thymus, and serum were measured using commercial ELISA assay kits. SS (2%) as drinking water increasedphagocytic activity by approximately 60% compared with the control. Levels of IL-2, IL-4, and TNF-α levels in spleen, thymus,and serum were not changed by SS treatments. However, IFN-γ in thymus showed a decrease in the 3% SS group comparedwith the control group. No significant differences in CBC counts and WBC differential counts were observed among experimentalgroups. These results suggest that SS treatments by drinking do not cause any toxicity and do not modulate immuneresponse as determined by cytokine levels in mice.

04 05 (21)이범준_가편집doi+1교+가제본+저자.pdf540.4KB

서 론

 규산염은 각종 규산의 수소가 금속 원자와 치환된 중성염의 총칭이며, 한 개 또는 더 많은 규소 중심원자가 음전하를 띤 리간드에 의해 둘러싸여 있는 음이온을 포함하는 화합물이며, 수용성 규산염은 유익한 미량원소를 포함하고 있는 광물질 조성물로서 탁월한 살균, 침투, 세포활성, 인화, 자정능력을 가진것으로 보고되었다 [2, 3, 8, 9, 17].

 마우스에서의 규산염의 작용은 많이 알려져 있지 않지만, 칼슘 공급원과 함께 골 대사에 영향을 미치며, 조골세포 형성에 관련된 유전자발현을 촉진시키고, 파골세포 형성에 관련된 유전자발현을 억제시킴으로써 뼈의 생화학적, 역학적 성질을 개선시키는 것으로 보고되었다 [13]. 또한 규산염 나노 입자가 망막에서 혈관 내피성장인자에 의해 유도되는 신생혈관형성을 억제하는 효과를 가지고 있다고 알려져 있다[9]. 또한 규산염 광물질 중 하나인 알루미노규산염은 비특이적인 면역을 향상시키는 역할을 한다는 연구가 알려져 있다 [10]. 이와 같이 규산염의 생체대사나 독성에 관련된 연구는 활발히 진행 중이지만, 그것이 면역계에 미치는 영향에 대한 연구는 현재 미미한 상황이다 [17].

 비장은 적혈구의 생산과 파괴, 면역세포인 T/B cell의 성숙을 담당하여 면역 시스템과 관계 깊은 장기이다. 최근에는 비장의 적색속질이 생체내의 monocyte를 절반 정도를 함유하는것으로 알려졌다. Monocyte는 항원이 생체에 침입하면 조직의 치유를 위해 수지상 세포나 대식세포로 분화된다 [1, 14, 16]. 또한 흉선은 면역반응에 관여하고 흉선유래림프구가 골수유래림프구의 항체 생성을 도와주는 역할을 하며 (helper T cells), 흉선유래 T cell은 CD4+와 CD8+ T cell, NK cell, B cell과 같은 다양한 종류의 면역 세포들의 활성, 증식, 기능 등을 억제할 수 있다 [11, 14].

 또한 cytokine 중 하나인 TNF-α는 주로 대식세포나 비만세포(mast cell)에 분비되는 cytokine으로서 종양세포 그리고 염증세포에 작용한다 [12, 14]. TNF-α는 대식세포 스스로를 활성화시키며, 동시에 세포 독성 영향을 지니고 다른 cytokine의 분비, 특히 대식세포에 작용하여 IL-1, PGE2 등의 분비를 자극하는 것으로 알려져 있다 [12]. Interleukin-1beta (IL-1β)는 catabolin으로 불리는 cytokine 단백질로 IL-1α와 함께 대식세포에서 분비된다. IL-1β는 염증 반응에 관여하는 중요한 cytokine이며, 세포 증식이나 분화, 세포 자살에도 연관되어 있다 [4~6]. IL-2는 cytotoxic T cell의 성장과 분화를 자극하고, 자가항원에 대한 면역 반응을 조절하는 regulatory T cell을 성숙시킨다. 항원이나 mitogen으로 활성화된 T lymphocyte에서 주로 생성된다 [4]. IL-4는 Th2 cell과 비만세포에 의해 생산되며, Th2 cell 분화를 촉진하고, Ig E 군의 클래스를 전환시킨다. IFN-γ는CD8+ T cell과 Th1 cell, NK cell에 의해 만들어져 면역반응을 조절한다 [7, 11].

 본 연구에서는 8주령 ICR mice에 농도별 (0%, 1%, 2%, 3%) sodium silicate를 음수의 형태로 2주간 급여한 후, 비장세포, 흉선세포, 혈청에서 단백질을 추출하여 cytokine을 정량 분석함으로써 규산염이 특정 cytokine 생산에 미치는 영향을 알아보았다. 또한 규산염의 면역 활성 여부를 알아보기 위하여 혈 중 대식세포의 탐식효율을 알아보았다.

재료 및 방법

시험물질 및 시약

 수용성 규산염 (sodium silicate, Na2SiO3, 13%)은 ㈜코시바이오 (충북 진천군, 한국)에서 공급받았으며, Cytokine 측정을 위한 ELISA kit는코마바이오텍(서울, 한국) 제품을사용하였다.

실험동물 및 실험기간

 본 실험에서는 중앙실험동물 (서울, 한국)에서 구입한 8주령 ICR 마우스를 사용하였다. 각 10수씩 4그룹으로 군 분리를 실시하였다. 동물은 6일간 순화기간을 가졌고, 고형사료를 자유급여하며, 2주간 음수에 sodium silicate를 0%, 1%, 2%, 3%의 농도로 희석하여 제공하였다. 복강내 대식세포의 탐식능을 알아보기 위한 Carbon clearance test를 수행하였다. 면역세포의 cytokine생성능을 확인해 보기 위한 복강 내 비장, 흉선 조직, 혈액샘플을 채취하였다.

 실험동물은 충북대학교 실험동물 연구 지원센터의 specific pathogen-free 시설에서 사육되었으며, 사육환경은 실내온도와 습도를 20±2℃와 50±20%가 되게 유지시켰고, 명암은 12시간의 간격을 두었다.

탐식능 검사(Carbon Clearance Test)

 2주간 마우스 음수에 sodium silicate를 0%, 1%, 2%, 3%의 농도로 희석하여 자유롭게 급여한 후, 혈액 내 carbon 탐식효율을 측정하였다. Carbon suspension (Indian ink, PILOT)을 5,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 1.5% gelatin(in saline)에 희석하여 30 ㎎/㎖가 되도록 하였다. 그 후 각군의 5마리씩10 ㎖/㎏의 용량으로 미정맥 투여하였다. 투여 후 안와정맥총 채혈(0분)과 투여 후 안와정맥총 채혈 (15분)을 실시하였다. 30 ㎕의 혈액을 0.1% sodium carbonate solution (Na2CO3) 1 ㎖에 용해시킨 후 600 ㎚에서 OD값을 측정하였다. 탐식효율을 산출하기위해Clearannce index (K)=(Ln OD t15 min)–(LnOD t0 min)/(t15 min–t0 min)을 이용하여 계산하였다.

혈액, 비장, 흉선조직 채취

 Ether 마취하에 복대정맥에서 혈액을 1 ㎖ 정도 채혈하였다. 혈액 0.3 ㎖는 혈청 K2-EDTA tube에 넣어 complete blood cell(CBC) count와 white blood cell (WBC) differential count를 실시하였고, 남은 혈액 0.7 ㎖를 사용하여 혈청을 얻었다. 방혈 후, 비장과 흉선을 채취하여 급속 냉동시킨 후 단백질 추출을 위해 냉동 보관하였다.

비장세포 및 흉선세포에서 단백질 추출

 비장, 흉선을 각각 homogenizer를 이용하여 분쇄하고, 새로운 tube에 옮긴 후, 600㎕ PRO-PREP™ solution 넣고, cell lysis를 위해 10~20분간 -20℃에 두었다. Cell lysis가 종결된 sample을 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 1.5 ㎖ tube에 옮겨 담았다. Bradford' method를 이용해서 단백질의 농도를 측정하였다.

ELISA Assay를 통한 Cytokine의 농도 측정

 본 실험에서 측정하고자 하는 cytokine들의 양을 알아보기 위해 상업적으로 판매되고 있는 ELISA kit를 ㈜코마바이오텍(서울, 한국)으로부터 구입하였다. 본 실험에서 측정했던 cytokine은 TNF-α와 IL-1β 총 2가지로 각각 96 well의 plate가 들어있는 ELISA kit 세트를 이용하였다. 실험에 들어가기에 앞서 모든 ELISA kit 용액들은 4℃의 오염되지 않는 조건에서 보관되었다. 또한 사용하기에 앞서 모든 샘플과 시료들은 상온(20~25℃)에 일정시간 두었다. 4 종류의 ELISA kit 모두 sandwich ELISA format의 원리를 가진 kit를 사용하였으며, 각각의 cytokine 종류마다 standard 범위 및 detection antibody의 농도가 약간 다를뿐, 나머지 전체적 실험과정은 ㈜코마바이오텍 (서울, 한국)에서 제공된 protocol에 따라 진행하였다.

통계처리

 실험 결과는 평균±평균오차 (Mean±S.E.)로 표시하였으며, 각 군 간의 평균치의 차이는 분산 분석(Analysis of Variance, Kruskal-Wallis nonparametric Anova) 및 Dunn's multiple comparisons를 사용하여 유의성을 검정하였다.

결 과

체중의 변화

 실험 시작일과 부검직전 증가된 체중을 측정하였다. 실험 2주간 체중 증가를 측정하였을 때, 대조군은 4.6±2.4g, 1%의 규산염 급여군에서 7.9±1.8g, 2%의 규산염 급여군에서 7.4±1.4g, 3%의 규산염 급여군에서는 7.3±1.4g 증가한 것으로 측정되었다 (Fig. 1). 그러나 각 실험군 간에는 유의적 차이를 보이지는 않았다. 대조군의 체중 증가율과 비교해 보았을 때, 1%, 2%, 3% 규산염 투여군의 체중 증가율이 각각 71.7%, 60.1%, 58.7% 향상되었다(Fig. 1).

Fig. 1. The body weight gain of mice treated with sodium silicate solution for 14 days. The data present the mean value ± S.E. (n=5).

Complete blood cell count(CBC)

 규산염을 농도별로 2주간 급여한 후, 복대정맥에서 채혈하여 CBC를 측정하였다. WBC는 대조군에 비해 규산염의 농도 증가함에 따라 WBC 수치가 증가하는 추세를 보였지만, 유의성은 나타나지 않았다 (Table 1). RBC와 hemoglobin은 투여군에서 미세한 감소를 보였으나, 유의적 차이는 없었다 (Table 1). 그밖에 다른 지표들이 Hct, MCV, MCH, MCHC 등도 대조군과 시험군에서 유의적 차이가 관찰되지 않았다 (Table 1).

Table 1 The complete blood cell counts in mice orally treated with sodium silicate solution for 14 days

WBC Differential Count

WBC differential count

 규산염을 농도별로 2주간 급여한 후, 복대정맥에서 채혈하여 Lymphocyte, Monocyte, Neutrophil, Eosinophil, Basophil를 측정하였다. Neutrophil의 규산염의 농도증가에따라 증가하는 추세를 보였지만, 대조군에 비해 유의성은 나타나지 않았다(Table 2). 또한 Lymphocyte, Monocyte, Eosinophil, Basophil의 수적 변화도 규산염 급여와 무관하게 측정되었다 (Table 2).

Table 2 The WBC differential counts in mice treated with sodium silicate solution for 14 days

Carbon clearance test (Phagocytic Activity)

 규산염을 농도별로 2주간 급여한 후, 혈액 내 carbon 탐식효율을 측정해보았다. 대조군의 탐식효율과 비교해 보았을때 2%의 규산염 급여군의 탐식효율이 59%, 3%의 규산염 급여군의 탐식효율이 8% 증가되었다 (Fig. 2).

Fig. 2. The phagocytic activity in the blood of mice treated with sodium silicate solution for 14 days. The data present the mean value ± S.E. (n=5).

IL-2의 농도 변화

 비장세포에서 IL-2 농도는 대조군보다 실험군에서 미세하게 증가하는 추세를 보였지만, 유의성은 나타나지 않았다 (Fig. 3). 흉선세포에서도 IL-2 농도는 대조군에서 비하여 3% 규산염 처치군에서 감소하였지만, 유의적 차이를 보이지 않았다 (Fig. 3). 혈청 내 IL-2 농도는 대조군에서 비하여 규산염 처치군에서 농도에 따라 증가하는 추세를 보였지만 유의성은 나타나지 않았다(Fig. 3). 비장이나 흉선에 비해 혈청에서 IL-2의 농도가 매우 높게 관찰되었다.

Fig. 3. The IL-2 production in spleen, thymus and blood serum treated with sodium silicate solution for 14 days. SS: sodium silicate. The data present the mean value ± S.E. (n=5).

IL-4의 농도 변화

 비장세포에서 IL-4 농도는 대조군과 실험군이 유의적 차이없이 비슷한수준으로 관찰되었다(Fig. 4). 흉선세포에서는 IL-4농도가 규산염의 농도에 따라 농도가 증가할수록 IL-4의 농도가 감소하는 추세를 나타내었지만 유의성은 나타나지 않았다 (Fig. 4). 혈청에서 IL-4 농도는 2%, 3% 규산염 급여군에서 규산염의 농도가 증가할수록 감소하는 추세를 나타내었지만 유의성은 나타나지 않았다 (Fig. 4). 비장이나 흉선에 비해 혈청에서 IL-4의 농도가 매우 높게 관찰되었다.

Fig. 4. The IL-4 production in spleen, thymus and blood serum treated with sodium silicate solution for 14 days. SS: sodium silicate. The data present the mean value ± S.E. (n=5).

IFN-γ의 농도 변화

 비장세포에서 INF-γ농도는 대조군에 비해 규산염 급여군에서 유의적 차이가 나타나지 않았다(Fig. 5). 흉선세포내 INF-γ 농도는 대조군에 비해 3%의 규산염 급여군에서 유의적으로 감소되었다 (p<0.01). 혈청에서 INF-γ 농도는 대조군과 실험군의 농도가 비슷한 수준으로 관찰되었다 (Fig. 5).

Fig. 5. The IFN-γ production in spleen, thymus and blood serum treated with sodium silicate solution for 14 days. SS: sodium silicate. The data present the mean value ± S.E. (n=5). **Significantly different from the control at p<0.01.

TNF-α의 농도 변화

 비장세포에서 TNF-α 농도는 대조군과 실험군의 농도가 비슷한 수준으로 관찰되었다(Fig. 6). 흉선세포에서는 TNF-α 농도가 대조군에 비해 1%, 2%의 규산염 급여군에서 증가하는 추세를 보였지만 유의성은 나타나지 않았다. 혈청 내 TNF-α 농도는 대조군과 실험군에서 유의적 차이가 나타나지 않았다 (Fig. 6).

Fig. 6. The TNF-α production in spleen, thymus and blood serum treated with sodium silicate solution for 14 days. SS: sodium silicate. The data present the mean value ± S.E. (n=5).

고 찰

 수용성 규산염은 유익한 미량원소를 포함하고 있는 광물질 조성물로서 여러 생리 활성 효과를 지니는 것으로 알려졌다 [2, 3, 8, 10, 13]. 규산염의 이러한 특성 중독성 및 면역계에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 수용성규산염을 마우스를 이용한 동물실험을 통해 수행하였다. 마우스를 순화한 후 2주간 다양한 규산염 농도 (1~3%)에서음수 급여 후 면역 관련 지표들을 확인하였다. 면역반응의 활성은 면역계 주요 작동세포인 대식세포,  lymphocyte, NK cell 및 여러종류의 cytokines에 의한 세포분화 자극을 통해 다양하게 발현되므로, 본 연구에서 비장세포, 흉선세포, 혈청에서 cytokines의 농도를 측정하였다[6, 11, 14]. 또한 규산염이 체내 탐식세포의 활성화를 통해 혈액 내 carbon탐식효율을 증가시키는지를 알아보기 위해 phagocytic index를 측정하였다.

 실험 시작일과 부검 직전 증가된 체중을 측정한결과, 대조군의 체중 증가율보다 1%, 2%, 3%의 규산염 투여군이 약 58~ 71% 향상된 증가율을 나타내었다. 이러한 결과는 수용성 규산염이 축산동물의 증체에 영향을 미칠 것으로 사료되며, 추후 가축에 적용하여 사료효율을 포함하여 추가적인 연구가 필요하다. 실제로 콜로이드 규산염인 montmorillonite는 bentonite라고도 불리는데, bentonite는 표면에 세균 독소가 결합되고, 박층사이로 수분을 흡수하여 가축의 건강상태를 개선시켜준다. 그리고 체내 미생물작용을 촉진시켜주고, 소화물을 희석 연화시켜주며, 스트레스를 경감시켜주는 효과가 있다 [8, 13].

 수용성 규산염의 2주간 투여에 의한 일반적 독성은 관찰되지 않았다. 임상적으로 특이한 증상이 없었으며, 생화학적, 혈액학적으로도 큰 변화가 없었다. 혈액검사 결과에서 WBC 수, 특히 neutrophil 수가 규산염농도에 따른 증가하는 추세를나타내었지만 유의성은 나타나지 않았다. 하지만 규산염을 장기간 투여하여 혈액검사 항목들의 변화 양상을 관찰하고, 그 의미를 검토할 필요가 있다고 생각된다.

 본 연구에서 carbon clearance test (phagocytic activity)의 결과, 2%의 규산염 투여군은 대조군보다 60% 가량 phagocytic activity가 향상되었다. 하지만1%, 3% 규산염 투여군에서 phagocytic activity가 대조군과 비슷한 수준을 나타내었다. 이러한 결과는 면역계에 어느 정도 영향을 미치는 것으로 사료되며, 추가적인 기전 연구가 필요하다. 마우스 동물실험에서 알루미늄 규산염을 식이로 급여시에 면역활성을 증진시키는것으로 보고 되었으며, 더불어 바이러스 감염돼지에서도 규산염 급여는 바이러스의 체내 clearance를 증진시켰다고 보고되었다 [10]. Al-Mogairen 등은 규산염 경구 혹은 피하 투여는 랫드에서 면역기능을 교란시켜 자가항체를 유도하거나 형성시키는 것으로 보고하였다 [2, 3].

 TNF-α는 주로 대식세포나 비만세포에서 분비되며, 종양세포나 염증세포에 작용하여 세포독성을 나타낸다 [12, 14]. IL-2는 항원이나 mitogen으로 활성화된 T lymphocyte에서 주로 생성되며, cytotoxic T cell의 성장과 분화를 자극하고, 자가 항원에 대한 면역 반응을조절하는 regulatory T cell을 성숙시킨다 [4]. IL-4는 Th2 cell과 비만세포에서 생산되며, Th2 cell 분화를 촉진하고, Ig E 군의 클래스를 전환시킨다. IFN-γ는 CD8+ T cell과 Th1 cell, NK cell에 의해 만들어져 면역반응을 조절한다 [7, 11, 15]. 본 연구에서 대조군과 실험군의 비장, 흉선, 혈청 내 L-2, IL-4, TNF-α 생성 분비능은 유의성을 나타내지 않고 비슷한 수준으로 조사되었다. 다만 3%의 규산염 투여군의 흉선에서 대조군의 흉선에 비해 IFN-γ 농도가 유의적으로 감소한것을 확인할 수 있었다. 따라서 2주간의 규산염 투여군은 체내 cytokine 분비에 큰 변화를 일으키지 않고 어떠한 독성도 나타내지 않았다. 본 연구에서 이러한 결과는 면역계 작용이 미미하거나 변화를 주지 않는 것으로 사료된다. 하지만 면역계가 활성화 되어도 자극원이 없다면 면역세포에서 분비하는 cytokine의 양이 매우 적어 그 농도를 측정하기 어렵다는 가능성을 고려해볼때 자극원을 이용한 실험을 검토해볼 필요가 있을 것이다.

 위 실험의 결과는 현재 수처리용, 농업용, 자동차용품용 등으로 사용되고 있는 규산염을 동물 증체용으로 사료 혹은 음수첨가제 개발 가능성을 시사하나, 수용성 규산염의 면역세포에 미치는 영향은 미미한 것으로 사료된다. 단지 carbon 탐식능력의 향상은 좀 더 그 기전에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.

감사의 글

 본 연구는 2012년도중소기업청 지원 산학연공동기술개발사업의 지원에 의해 수행되었으며, 또한 2012년도정부(교육과학
기술부)의 재원으로 한국연구재단의 대학중점연구소 지원 사업(2009-0094034)으로 수행된 연구입니다.

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