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ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.37 No.1 pp.7-12
DOI :

Immunomodulatory activity of sodium silicate containing selenium in LPS-stimulated immune cells

Beom Jun Lee1, †, Ja-Seon Yoon1, Joon Yeop Lee1, Nak Young Baek2, Bong Su Kang1, Ji Young Yun1, Dang-Young Kim1, Ja Kyoung Seol1, Young Won Yun1, Sang Yoon Nam1, Jae-Hwang Jeong3, Jong-Soo Kim1,‡
1College of Veterinary Medicine and Research Institute of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Cheongju 361-763, Republic of Korea
2Koshibio Inc., Jincheon 365-861, Republic of Korea
3Department of Biotechnology and Biomedicine, Chungbuk Province College, Okcheon 373-807, Republic of Korea
Received 6 March 2013, revised 19 March 2013, accepted 21 March 2013

Abstract

Selenium salts are toxic in large amounts, however, trace amounts are necessary for cellular function in manyorganisms, including all animals. Selenium is a component of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase and thioredoxinreductase (which indirectly reduce certain oxidized molecules in animals and some plants). In addition, sodium silicate(Na2SiO3) possesses a number of biological activities, especially in improvement of cell growth. However, few studies on theeffects of sodium silicate and selenium on an immune system have been reported so far. The objective of this experimentwas to investigate the effect of soluble sodium silicate/Se on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory response inRAW264.7 cells. The production of nitric oxide (NO) and proinflammatory cytokines was examined in lipopolysaccharide(LPS)-stimulated RAW264.7 cells. The cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM). Concentration of10 ppm or less of soluble sodium silicate/Se had no cytotoxic effect on RAW264.7 cells. The soluble sodium silicate/Sedecreased LPS-induced production of NO but did not affect the levels of TNF-α, IL-2, and IFN-γ in RAW264.7 cells. Inaddition, the sodium silicate/Se induced up regulation of IL-1β level in a dose-dependent manner. These results suggest thatthe soluble sodium silicate/Se has a synergistic effect in down-regulation of inflammatory response in vitro.

02 김종수_가편집-1교+가제본.pdf453.2KB

서 론

셀레늄 (selenium)은 필수 미량원소로서 단백질 내의 selenomethionine 또는 selenocysteine으로 존재하며, 세포들이 산화성 손상을 입게 되는 것을 방지하는 glutathione peroxidase의 활성에 필수요소로 작용한다[4]. 또한 셀레늄은 세포의 항산화 방어에도 중요한 역할을 하며, 후천성 면역 결핍증 등 염증 질환을 가진 환자에게 효과가 있다고 알려져 있다 [5]. 그리고 셀레늄은 유기 수은과 반응하여 복합체를 형성함으로써 수은에 의한 산화적 스트레스의 유발을 차단함으로써 유기 수은에 의해 유도되는 세포 독성 및 apoptosis에 방어적 효과를 나타내며 [2], 식이적으로 셀레늄을 섭취했을 때, 산화적 스트레스 감소, connexin-43 dephosphorylation 억제, TNF-α의 발현 감소 등을 통해 심장을 보호하는 것으로 보고되었다 [14].

 한편, 규산염은 물에 쉽게 용해되어 알칼리성을 나타낸다. 마우스에서의 규산염의 작용은 칼슘공급원과 함께 골대사에 영향을 미치며, 뼈 모세포형성에 관련된 유전자 발현을 촉진시키고, 뼈 파괴 세포형성에관련된  유전자 발현을 억제시킴으로써 뼈의 생화학적, 역학적 성질을 개선시키는 것으로 나타났다 [10]. 그리고 규산염 나노입자가 망막에서 혈관 내피 성장인자에 의해 유도되는 신생 혈관 형성을 억제하는 효과를 가지고 있다고 알려져 있다 [7].

최근의 연구에서 L-arginine이 세포내에서 대사될 때 guanidino nitrogen의 산화에 의하여 L-citrulline과 같은 양으로 생성되는 반응질소 대사산물인 nitric oxide (NO)는 염증 반응 및 기타 면역반응에 있어서  세포성 면역의 분자 생물학적 지표로 여겨지고 있으며 [11], 반감기가 4~6초 정도인 nitric oxide는 그 대사물인 nitrite 및 nitrate를 측정함으로써 NO의 생성을 간접적으로 측정할수 있다 [6]. 따라서 soluble sodium silicate/Se을 투여하여 NO를 측정하면 세포성 면역에 영향을 미치는 정도를 얻을 수 있다. 그리고 RAW264.7 cell line은 IL-1 또는 INF-γ 등과 같은 cytokine의 자극만으로도 스스로 nitrite를 생성하는 특성을 가지고 있어  세포독성을 갖는 물질들의 독성 검정을 위해 유용하게 사용될 수 있다 [15]. 따라서soluble sodium silicate/Se을 적정농도로 자극했을 때 세포생존율이 기존배지와 같은 정도로 유지되는 농도를 결정하고, 세포들이 갖는 기능을 확인함으로써, soluble sodium silicate/Se에 의한 대식 세포의 영향을알아볼 수있다. 그리고 cytokine 중 하나인TNF-α는 주로 대식 세포나 비만세포(mast cell)에서 분비되는cytokine 으로서 종양 세포 그리고 염증 세포에 작용한다. TNF-α는 대식 세포 스스로를 활성화시키며, 동시에 세포 독성 영향을 지니고 다른 cytokine의 분비, 특히 대식 세포에 작용하여 IL-1, PGE2등의 분비를 자극하는 것으로 알려져있다 [8]. IL-1β는 catabolin으로 불리는 cytokine 단백질로 IL-1α와 함께 대식 세포에서 분비된다. IL-1β는 염증 반응에 관여하는 중요한 cytokine이며, 세포 증식이나 분화, 세포 자살에도 연관되어 있다 [3].

 따라서 본 실험에서는 soluble sodium silicate/Se을 RAW 264.7 세포에 염증물질인 lipopolysaccharide (LPS, 1 ㎍/㎖)와 함께 처리했을 때, NO assy와 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법을통해 NO의생성량및 cytokine의 생성량을 정량 분석함으로써, soluble sodium silicate/Se가 마우스 면역 세포인 RAW264.7 세포에 미치는 영향에 대해 알아보았다.

재료 및 방법

시약 및 실험 기기

 본 실험에 사용한 soluble sodium silicate/Se (Se, 50 ppm)은 ㈜코시바이오 (충북 진천군, 한국)에서 공급받았으며 RAW264.7 세포는 한국 세포주 은행에서 분양받았다. 실험에 사용된 시약인 LPS (Escherichia coli O26:B)는 SIGMA (St.Louis, USA)사에서 구입했고, CCK-8 assay는 Dojindo laboratories (일본)사에서 구입했으며, Griess reagent system은 Promega (미국)사에서 구입했다. TNF-α, IL-1β, IL-2, IFN-γ 측정용 ELISA kit는 코마바이오텍 (서울, 한국)에서 구입했다.

세포배양

 마우스 대식 세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행으로부터 공급받아 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 2회 원심분리를 반복하여 세척한 다음, ∅100×20 ㎜의 cell culture용 dish에 2×106 /㎖ 밀도로 37℃, humidified, 5% CO2  환경에서 24시간 배양 후, 2~3회 계대를 거쳐 실험에 사용하였다.

농도별 soluble sodium silicate/Se 용액 준비

 Selenium으로서 50 ppm의 soluble sodium silicate/Se을 FBS와 항생제가 불포함된 DMEM 배지와 1:1로 희석 후 pH를 측정했다. pH가 7.5 정도로 측정되어 별도의 pH 조정 과정을 거치지는 않았다. 1:1로 희석한 soluble sodium silicate/Se을 clean bench 내에서 pore size가 0.2 ㎛인 필터 (sartorius, 독일)를 이용하여 세균을 거른 다음 FBS와 penicillin/streptomycin을 희석한 soluble sodium silicate/Se의 각각 10%, 1% 씩 넣어주었다. 여기에 FBS와 항생제가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 농도별로 시료를 제작하여 실험에 사용하였다.

세포 생존율 검사

 Soluble sodium silicate/Se의 농도별 세포 생존율을 알아보기 위하여10% FBS와 1% P/S가 포함된100 ㎕의 DMEM 배지와 RAW264.7 세포 (1×10⁴cells/well)를 96-well culture plate에 넣고 standard incubator conditions (37℃, humidified, 5% CO2 /95% air environment)에서 24시간 배양한 다음, 상층액을 제거하고 일반배지와 여러 농도의 soluble sodium silicate/Se을 처리하여 24시간 배양하였다. 각 well에 10 ㎕의 CCK-8 시약을 넣은 후 1시간 동안의 배양시간을 거쳐 발색 정도를 microplate reader를 이용하여 파장 450 ㎚에서 흡광도를측정하였으며, 일반배지에서배양한 대조군의세포 생존율과 soluble sodium silicate/Se을 농도별로 처리한 실험군의 세포 생존율을 비교하였다.

NO 및 cytokine 측정용 시료의 배양

 10% FBS 및1% P/S가포함된 2 ㎖의 DMEM 배지와RAW 264.7 세포 (2×10⁶ cells/well)를 6-well culture plate에 넣고 standard incubator conditions (37℃, humidified, 5% CO2 /95% air environment)에서 24시간 배양한 다음, 상층액을 제거했다. 여기에 1 ㎍/㎖의 농도로 LPS를 처리한 soluble sodium silicate/Se을2 ㎖씩넣고다시24시간배양한후 상층액을 분리하여 냉동실에 보관하여 사용하였다.

NO 생성량 측정

 NO 측정용으로 배양된 배양액50 ㎕를 96 well plate에 분주했다. Griess reagent (1% sulfonamide+N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride+2.5% phosphoric acid)를 각각 50 ㎕씩 넣고, 각각 10분간 반응시킨 다음, 발색을 확인하고 발색 정도를 microplate reader를 이용하여 파장 540 ㎚에서 흡광도를 측정했다. 각 실험군의 NO 생성량은 0~100 μM의 sodium nitrite를 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 NO 농도를 구하여 환산하였다. Soluble sodium silicate/Se, LPS 모두 처리하지 않은 대조군의 NO 생성량과 LPS와 soluble sodium silicate/Se을 농도별로 처리한 군을 실험군의 NO 생성량을 비교하였다.

Cytokine 생성량 측정

 본 실험에서는 TNF-α, IL-1β, IL-2, IFN-γ 4종류의 cytokine의 생성량을 측정했다. ELISA kit는 모두 sandwich ELISA format의 원리를 가진 kit를 사용하였으며, 각각의 cytokine 종류마다 standard 범위 및 detection antibody의 농도가 약간 다를뿐, 나머지 전체적 실험과정은 코마바이오텍(서울, 한국)에서 제공된 프로토콜에 따라 진행한 다음, 450 ㎚에서 흡광도를 측정하고, 측정된 표준곡선으로부터 각 cytokine의 농도를 환산하였다. LPS와 soluble sodium silicate/Se을 처리하지 않은 대조군의 cytokine 생성량과LPS와 soluble sodium silicate/Se을 농도별로 처리한 것을 실험군의 cytokine 생성량을 비교하였다.

통계처리

실험 결과는 평균 (mean)과 표준 편차 (standard deviation; SD)로 나타냈으며, 실험군 간의 통계학적 분석은 DUNNETTT test (Multiple Comparisons vs Control Group)를 사용하여 P<0.05 이하인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결 과

RAW264.7 세포에 대한 독성

Soluble sodium silicate/Se에 대한 세포 생존율은 CCK-8측정법을 이용하였다. LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에 Se 농도별로 soluble sodium silicate/Se을 처리하여 24시간 후 세포 생존율을 측정한 결과, soluble sodium silicate/Se의 농도가10 ppm까지는 일반배지에서 배양한 대조군과 유의적인 차이가 없었으나, soluble sodium silicate/Se의 농도가 15ppm에서는 대조군 대비 86±2.6%의 세포 생존율을 나타내어 세포사멸이 진행되는 것으로 나타났다 (P<0.05, Fig. 1). 또한 LPS (1.0 ㎍/㎖) 유무에 따른 soluble silicate/Se의 농도별 세포 생존율은 통계학적으로 유의하지 않은 것으로 나타났다 (Fig. 2). 따라서 soluble sodium silicate/Se의 처리농도를 세포 생존율에 영향을 주지 않는 10 ppm 이하에서 실험을 진행했다.

Fig. 1. Effects of sodium silicate/Se on the viability of RAW 264.7 cells. RAW264.7 cells were incubated in the presence or absence of sodium silicate/Se (0 to 20 ppm) for 24 h. Cell viability was determined by CCK-8 assay. Data are presented as means±S.D. of three independent experiments. *Significantly different from the control group (P<0.05). **Significantly different from the control group (P<0.01).

Fig. 2. Effects of sodium silicate/Se on the viability of RAW 264.7 cells in the presence/absence of lipopolysaccharide (LPS). Cell viability was determined by CCK-8 assay. RAW264.7 cells were incubated in the presence or absence of sodium silicate/Se (0 to 10 ppm) for 24 h.

Nitric oxide 생성량

RAW264.7 마우스 대식 세포에서 soluble sodium silicate /Se이 LPS (1.0 ㎍/㎖)에 의해 생성되는 nitric oxide 생성량에 미치는 영향을 알아보기 위해 실험을 실시하였다. 일반배지에서 LPS (1.0 ㎍/㎖) 유무에 따른 NO의 생성량은0.91 ㎛에서34.02 ㎛로 LPS를 투여 시 통계학적으로 유의하게 증가했다 (P<0.01, Fig. 3). 반면, LPS(1.0 ㎍/㎖)를 처리했을 경우에는 일반배지를 처리한 대조군과 비교하여 soluble sodium silicate /Se을 2.5, 5, 7.5 및10 ppm으로 처리한 실험군에서 NO의 생성량이 통계학적 유의성을 가지고 농도 의존적으로 감소했다 (P<0.01, Fig.3).

Fig. 3. Effect of sodium silicate/Se on production of nitric oxide in RAW264.7 cells for 24 h in the presence of ipopolysaccharide (LPS, 1.0 ㎍/㎖). Data are presented as means±S.D. of three independent experiments. **Significantly different from the control group (P<0.01). ††Significantly different from the control group with LPS (P<0.01).

TNF-α 생성량의 변화

 일반배지에서 LPS (1.0 ㎍/㎖) 유무에 의한 TNF-α 생성량은 각각 0.42±0.29 ng/㎖, 374.15±20.88 ng/㎖로 LPS를 처리 시 통계적으로 유의하게 증가했다 (P<0.01, Fig 4). 그러나 LPS(1.0 ㎍/㎖)를 처리했을 경우에는 일반배지에서 처리한 대조군과 비교하여soluble sodium silicate/Se을 2.5, 5 및10 ppm으로 처리한 실험군에서의 TNF-α 생성량이 각각 383.13±18.82 ng/㎖, 376.41±9.61 ng/㎖ 그리고 381.64± 23.37 ng/㎖로 측정되어, 통계학적 유의성을 나타내지 않았다 (Fig. 4).

Fig. 4. Production of TNF-α by soluble sodium silicate/Se at various concentrations in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide (LPS, 1.0 ㎍/㎖) for 24 h. Data are presented as means±S.D. of three independent experiments. **Significantly different from the control group (P<0.01).

IL-1β 생성량의 변화

일반배지에서 LPS (1.0 ㎍/㎖) 유무에 따른 IL-1β 생성량은 1.07±0.41 pg/㎖, 14.59±1.32 pg/㎖로 LPS를 처리 시 통계적으로 유의하게증 가했다(p<0.01, Fig. 5). 또한 LPS (1.0 ㎍/㎖)를 처리했을 경우에는 일반배지에서 처리한 대조군과 비교하여 soluble sodium silicate/Se을 2.5, 5 및 10 ppm으로 처리한 실험군에서의 IL-1β의 생성량이 각각 20.50±2.62 pg/㎖, 20.42±1.04 pg/㎖, 62.30±1.39 pg/㎖로 측정되어, 통계적으로 유의하게 증가하는 것으로 나타났다 (P<0.01, Fig. 5).

Fig. 5. Production of IL-1β by soluble sodium silicate/Se at various concentrations in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide (LPS, 1.0 ㎍/㎖) for 24 h. Data are presented as means±S.D. of three independent experiments. **Significantly different from the control group (P<0.01). ††Significantly different from the control group with LPS (P<0.01).

IL-2 생성량의 변화

 일반배지에서 LPS (1.0 ㎍/㎖) 유무에 따른 IL-2 생성량은 통계학적유의성을나타내지않았다(Fig. 6). 또한LPS (1.0 ㎍/㎖)를 처리한 군에서도 일반배지를 처리한 대조군과 비교하여 soluble sodium silicate/Se을 처리한 실험군에서의 IL-2 생성량은 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타나, soluble sodium sili- cate/Se이 IL-2 생성량의 변화에 영향을 미치지 않았다(Fig. 6).

Fig. 6. Effect of soluble sodium silicate/Se and lipopolysaccharide (LPS, 1.0 ㎍/㎖) on production of IL-2 in RAW264.7 cells for 24 h. Data are presented as means±S.D. of three independent experiments.

IFN-γ 생성량의 변화

일반배지에서 LPS (1.0 ㎍/㎖) 유무에 따른 IFN-γ 생성량은 통계학적 유의성을 나타내지 않았다 (Fig. 7). 또한 LPS (1.0 ㎍/㎖)를 처리한 군에서도 일반배지를 처리한 대조군과 비교하여 soluble sodium silicate/Se을 처리한 실험군에서의 IFN-γ 생성량은 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타나, soluble sodium silicate/Se이 IFN-γ 생성량의 변화에 영향을 미치지 않았다 (Fig. 7).

Fig. 7. Effect of soluble sodium silicate/Se and lipopolysaccharide (LPS, 1.0 ㎍/㎖) on production of IFN-γ in RAW264.7 cells for 24 h. Data are presented as means±S.D. of three independent experiments.

고 찰

이 연구는 면역 체계에 있어 중요한 역할을 담당하는 대식 세포의 면역 활성과 관련하여 soluble sodium silicate/Se가 마우스 대식 세포인 RAW264.7 세포에서 세포 생존율, NO 및 cytokine의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위해 실시하였다. Soluble sodium silicate/Se을 RAW264.7 세포에 24시간 처리했을 때10 ppm 이하의 농도에서는 세포 독성이 거의 없는 것으로 나타났다. LPS와 동시 투여에서도 10 ppm 이하에서는 세포 독성은 나타나지 않았다.

 Soluble sodium silicate/Se이 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 미치는 영향을 비교한 결과, sodium silicate/Se을 24시간 처리하였을 때 LPS에 의해 유발된 NO 생성 증가를 통계적 유의성을 가지고 감소시킨 것으로나타났다. 이것은 sodium silicate /Se는 LPS에 의해 유발된 RAW264.7 대식 세포의 NO 생성 증가를억제하여NO 과잉 생성으로 인한 염증을 감소시키는 항염증 효과가 있다는 것을 의미한다. NO는 NADPH 의존적 효소인 세가지 형태의NO 합성경로(NO Synthase pathway; NOS)를 통해 L-arginine이 산화되어 citrullin으로 변환되는 과정에서 형성되는 중간 생성물이다. 이들 NOS 중 endothelial NOS(eNOS) 와 neuronal NOS (nNOS)는 칼슘 농도에 의존적이고 자극에 대한 반응이 아닌 구성성분으로서 일시적으로 소량 발현된다. 반면, inducible NOS(iNOS)는 칼슘의 농도에 상관없이 염증 자극에 의해 지속적으로 다량 생성이 유도됨으로써 염증 반응에 기여하게 된다 [9]. iNOS는 일반적으로 대식 세포, 내피 세포, 혈관 평활근 세포와 간세포 등 여러 세포에서 TNF-α, IL-1β, IFN-γ와같은 염증성 자극에 의해 유도되는 것으로 알려져 있으며, 특히 LPS 또는 세균의 lipopeptide를 처리하였을 때 급격히 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다 [13]. 한편, NO는 원래 염증성 또는 항염증성의 기능을 동시 갖는 것으로 알려져 있으나, 생체내 과도한 분비는 오히려세포 독성을 통해 세포를 파괴하고shock에의한혈관확장및염증반응을 촉진하여조직손상을 유발하는 것으로 알려져 있다 [1].

 Cytokine은 일반적으로 복수의 작용을 나타내며, 다른 cytokine이 같은 활성을 나타내는 경우가 적지 않아 각 cytokine 은 독립적으로 작용함과 동시에 관련을 가지고 연쇄 반응을 한다[12]. 본 연구에서 cytokine 생성에 대한 영향을 비교한 결과, LPS로 유발된 RAW264.7 세포에 soluble sodium silicate/Se 을 24시간 처리하였을 때, 모든 농도에서 LPS에 의한 TNF-α의 생성 증가를 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 또한IL-2, IFN-γ 는 LPS 처리 유무 및 sodium silicate/Se의 농도와 상관없이 생성량이 미미하고 통계적으로 유의성이 없는 것으로 나타나, NO의 생성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 반면, IL-1α와 함께 대식 세포에서 분비되며, 염증 반응에 관여하는 중요한 cytokine으로 알려진 IL-1β 생성량은 처리한 soluble sodium silicate/Se의 농도와 비례하여 증가하였다 [12]. 위의 결과들을 종합해 볼 때, sodium silicate/Se이 RAW264.7 세포에서 LPS 에 의해 생성되는 염증물질인 TNF-α, IL-2, IFN-γ는 억제하지 못하는 것으로 나타났고, IL-1β는 오히려 증가한 것으로 나타나 soluble sodium silicate/Se의 항염증 효과에 대해서는 명확한 판단을 내리기가 어렵다고 판단된다. 다만 iNOS의 생성을 유도하는 염증성 자극물질로 알려진 TNF-α, IL-2, IFN-γ 그리고 IL-1β 외에 IL-1α, IL-6, IL-13과 같은 전염증 물질에 대한 연구와 더불어 sodium silicate와 selenium 각각의 최적농도에서의 항염 효과에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.

감사의 글

 본 연구는 2012년도중소기업청 지원 산학연공동기술개발사 업의 지원에 의해 수행되었습니다

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