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ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.37 No.1 pp.24-28
DOI :

Rapid, sensitive and specific detection of Brucella canis by real-time PCR assay using HybProbe

Moon Her†, Sung-Il Kang, Ji-Yeon Kim, Kichan Lee, Jong-Wan Kim, Hyang-Keun Lee, So-Ra Sung, Hyorim Cho, Suk Chan Jung
Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency, Anyang 430-757, Republic of Korea
Received 30 January 2013, revised 19 March 2013, accepted 21 March 2013

Abstract

We designed and evaluated a specific HybProbe set for identification of Brucella canis, which is based on a specificsingle nucleotide polymorphism (SNP) of the omp25 gene. Real-time PCR assay using this probe specifically identified B.canis reference and field strains, however, the other Brucella species and general bacteria strains were not amplified. Thisreal-time PCR assay can re-confirm specific amplification in melting curve analysis. The average melting temperature valuesfor generation of B. canis strains was 67℃, however, that of the other Brucella species was 62℃, due to a single base-pairmismatch at the binding site of the probe. The detection limit appeared to be 30 fg of DNA and 100 CFU by serial dilutionof whole blood inoculated with B. canis. In addition, use of the buffy coat resulted in approximately 50 times higher sensitivitythan whole blood directly. This technique is widely applicable for use in diagnostic laboratories and is readily discriminativewith regard to small amounts of biomass.

05 허문_가편집_1교_저자+가제본.pdf1.04MB

서 론

 브루셀라균은 그람 음성의 세포내 기생세균으로서 주요 인수 공통 전염병 중의 하나로, 이균은 세계적으로 널리 퍼져있으며, 가축 산업과 공중보건에 영향을 주어 사회․경제적으로 상당한 문제를 야기시키고 있다. 주로 선진국보다는 개발도상국이나 저개발국에서 많이 보고되고 있다 [5, 16].

현재 브루셀라균은 10종이 알려져 있으며, 이들 중 B. abortus, B. canis, B. suis, B. melitensis는 사람에게 전이되어 브루셀라병을 일으킬 수 있다[7, 23]. 전파 경로는 감염된 태반 조직, 유산 태아, 생식기 분비물을 통해 직․간접적으로 감염될 수 있다 [10].

 브루셀라병 진단은 주로 배양학적, 혈청학적 진단 방법을 사용하고있다. 보통 균분리 기간은 7일 이상 소요되며. 혈청학적인 방법은 혈청에서 항체를 측정하여 진단하지만 2~3가지 방법을 병행해야 하며, 위양성 등 비특이 반응으로 인해 해석하기 곤란한 점이 있다 [6, 13]. 최근에는 브루셀라균을 간단하고, 빠르게 진단하기 위해서 분자․유전학적 방법이 많이 사용되고 있다. 이러한 방법으로 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 다양한 PCR 진단법, southern blot hybridization 분석법, 제한효소 처리법 및 고리매개 등 온유전자 증폭법(LAMP-PCR) 등이 보고되고 있다 [20]. 또한 최근에 많이 사용하고 있는 real-time PCR 법은 주로 SYBR Green, TaqMan probe, Hybridization probe 방식을 사용하고 있는 것으로 알려져 있다 [21, 22]. 그 중, SYBR Green 방식은 double strand에 무조건 binding 하기 때문에 민감도와 특이도가 낮다. TaqMan probe은 형광 dye에 반응이 일어나 에너지를 내어 PCR 증폭 산물을 측정할 수있 으나, probe가 이미 taq의 5’-exonuclease activity에 의해 분해되었기 때문에 melting curve 확인이 불가능하다. 반면에, hybridization probe (Hybprobe) 방식은 증폭산물과 형광세기를 실시간 모니터링을 통하여 melting curve로 non-specific product, primer dimer, primer pair 등을 확인할 수 있는 장점을 가지고 있다.

 따라서 본 연구는 국내에서 분리되고 있는 B. canis에 대한 진단을 위해 특이적인 Hybprobe을 제작하여 real-time PCR 법으로 특이성과 민감도를확인하였으며, 효과적인 전처리 과정을 통해 검출한계를 높여 진단의 효율성을 제고하였다.

재료 및 방법

균주 및 배양

본 연구에 사용된 균주는 10종 브루셀라 표준균주인 B. abortus 544, B. canis RM6/66, B. suis 1330, B. ovis 63/290, B. neotomae 5K33, B. melitensis 16M, B. ceti B1/94, B. pinnipedialis B2/94, B. microti CCM4915, B. inopinata B01을 사용하였다. 또한 2002~2010년까지 6개 지역 (경기, 인천, 전북, 경북, 전남, 충남)의 농장에서 분리한 20개의B. canis 분리균주를 이용하였으며, 이들은 모두 classical biotyping assay에 의해 동정되었고 [19], 16S rRNA PCR (F4/R2) 및 multiplex PCR를 이용하여 확인되었다 [12]. 브루셀라균과 연관된 Ochrobactrum anthropi, Esherichia coli O157:H7, Yersinia enterocolitica O:9 등 3종의 일반 균주는 특이성을 확인하기 위해 사용되었다. 브루셀라균 배양을 위해 tryptic-soy agar (TSA)와 broth (TSB) 및 항생제가 첨가된 Brucella 선택배지에 5%  소혈청이 첨가된 배지를사용하였다[8]. 배양은 5%  CO2 배양기에서 37℃, 3일간 배양하였다. 비 브루셀라 균주는 MacConkey와 5% sheep blood 배지에서 37℃, 1~2일간 배양하였다.

DNA 및 Buffy coat 추출

 분리주의 genomic DNA은 Blood & Tissue kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였으며, 전혈에서도 같은 방법으로 DNA을 추출하여 사용하였다.

Buffy coat의 추출은 전혈 1 ㎖에 Histopaque sol. (비중 1.083 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 1 ㎖를 첨가한 후, 원심분리기1,500 g×30 min 동안 원심분리하여형성된plasma 와 Histopaque sol. 사이에 있는 백색 띠 (buffy coat)를 회수하였다. 회수한 buffy coat는 proteinase K를 37℃에서 10 min 동안 가수분해한 후, 60℃에서 2 hr 동안 반응시켜 상기 kit manual에 따라 DNA을 추출하였다.

Hybprobe probe 설계 및 증폭 최적조건

 B. canis의 특이적 primer pairs와 probe는 기존에 보고된 omp25 gene을 활용하였으며, CLC Main Workbench software version 6.0 (Insilicogen Inc., Aarhus N, Denmark)을 이용하여 10종의 브루셀라균 omp25 유전자 염기서열을 비교 분석하였다. B. canis chromosome (GenBank accession number: CP000872)의 687211번 염기서열이 adenine에서 cysteine으로 변환되어 이 부위가 B. canis의 특이 SNP임을 확인하였다. 따라서 이 부위를 중심으로 BEACON designer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 primer와 probe을 설계, 제작하였다. PCR 산물의 크기는 115 bp이다 (Table 1).

Table 1. Primers and probes for detection of B. canis using specific SNP

Real-time PCR은 5×genotyping master 4.0 ㎕, 각 primer 0.5 ㎕, 각probe 0.3 ㎕, D.W 12.4 ㎕, DNA 2.0 ㎕를 혼합하여 PCR plate에 분주한 후, plate 속의 bubble을 제거하기 위해 원심분리기로 1,500 g×2 min 동안 원심분리시킨 다음, real-time PCR 기기 (Roche Diagnostic, Mannheim, Germany)로 최적반응조건에서 증폭하였다 (Table 2).

Table 2. Reaction condition of real-time PCR with HybProbe

특이도 및 민감도 분석

 브루셀라균 10종의 표준균주와 각 지역의 B. canis 대표 분리 균주 20주 및 브루셀라균과 연관된 3종의 일반세균에 대하여 real-time PCR의 특이성을 확인하였으며, melting curve 분석을 통해 B. canis 균주와 다른 균주와의 melting 온도의 차이로 재검증하였다.

또한 B. canis의 검출 한계를 조사하고자 Nanodrop ND-1000 UV/VIS spectrophotometer (Nanodrop Tech., USA)을 통해 표준균주의 genomic DNA의 농도를 확인하고, 단계적으로 10진 희석 (30 ng∼3 fg)하여real-time PCR의 민감도를 측정하였다.

전혈을 이용한 검출한계 비교검사

 B. canis를 인공 감염시켜 혈액에서 검출한계를 비교 확인하였다. 우선 TSB에 colony를 현탁하여 10진 단계로 희석한 후, 희석액 0.2 ㎖를 개 혈액 1.8 ㎖이 담긴 각 tube에 첨가하여 37℃, 2 hr 동안 정치시킨다. 여기에서 각각 0.2 ㎖의 전혈에서 직접 DNA을 추출하거나, 1 ㎖의 전혈에서 buffy coat을 분리하여 DNA을 추출하고, 이를 template로 이용하여 real-time PCR 법의 검출 범위를 확인하였다. 각각 희석된 tube에 함유된 균수를 측정하기 위하여 TSA 배지에 희석액 0.1 ㎖를 분주하여 3일 배양 후 균체 수를 측정하였다.

결 과

 B. canis를 특이적으로 검출하기 위한 real-time PCR 법을 개발하고자 기존에 보고된 omp25 gene에서 특이적인 SNP을 찾아 Hybprobe을 제작하였다. Brucella 10종의 표준균주, B. cani 분리균주 및 브루셀라 균주와 연관된 다른 세균을대상으로 real-time PCR을 수행하였다. 그 결과, B. canis 표준균주 및 분리주를 특이적으로 증폭하였고, 이들을 제외한 다른 Brucella species 균과 다른 세균들은 흡광도0.1 이하로 증폭을 확인할 수 없었다 (Fig. 1). 또한 melting curve analysis에서도 B. canis 표준균주 및 분리주들은 probe와 상호 염기 서열이 일치되어 melting 온도가 67℃로 확인된 반면, B. canis을 제외한 다른 브루셀라 균주들은 SNP 부위에서 불일치 (mismatching)하여melting 온도가 62℃로 구별됨으로서 B. canis가 특이적으로 증폭된 것임을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). B. canis 특이 real-time PCR 법의 민감도를 조사하기 위하여 genomic DNA 농도를 30 ng에서 3 fg까지 증류수에 10 진법으로 희석하여 검출한계를 측정한 결과, CT  (cycle threshold value)값은 18∼39로 30 fg까지 검출 가능하였다 (Fig. 3).

Fig. 1. Specific amplification of B. canis strains by the real-time PCR assay using HybProbe.

Fig. 2. Melting curve analysis for amplification of B. canis strains by the real-time PCR assay using HybProbe.

Fig. 3. Sensitivity of real-time PCR using B. canis DNAs diluted 10-fold serial dilution. The DNA concentrations are performed from 30 ng to 3 fg.

또한 전혈에서의 민감도를 비교하기 위해서 혈액에서 직접 DNA를 추출한 경우와 Histopaque sol.을 이용하여 5배 농축된 buffy coat를 분리하여 DNA를 추출한 경우를 비교하였다. 혈액의 경우는 100 CFU까지 검출된 반면, Buffy coat의 경우 2 CFU까지 검출되어 혈액보다는 buffy coat에서 50배 이상 검출 한계가 향상되는 것으로 확인되었다 (Fig. 4). 

Fig. 4. Comparison of detection limit of real time PCR in whole blood sample. Strain diluted by 10-fold serial dilution method was inoculated to whole blood. (A) DNAs extracted to whole blood cells directly. (B) DNAs extracted to buffy coat concentrated 5 times using histopaque 1.083. The number of strains are calculated by colony forming unit (CFU).

고 찰

 브루셀라병은 전 세계적으로 발생하고 있는 인수공통 전염병으로 신속한 진단이 요구되는 중요한 인수공통 전염병이다 [3, 7]. 현재 국내에서는 주로 소와 개에서 B. abortus와 B. canis로 보고되고 있다 [9, 11, 15]. 브루셀라병은 유산 이외에는 특별한 임상증상을 보이지 않아 쉽게 간과하는 경우가 많다. 최근 반려 동물로서 애완견을 기르는 가정이 늘고 있어 감염 유무를 신속하고 정확하게 검출할 필요가 있다[2]. 브루셀라 신속 검출 진단법에는 일반 PCR 및 real-time PCR 등 다양한 기법이 보고되고 있지만, 이 연구에서 수행한B. canis 종만을 특이적으로 검출하는 방법은 매우 제한적이다 [4].

따라서, 본 연구는 기존에 보고된 25 kDa outer-membrane immunogenic protein을 encoding한 omp25 gene에서 B. canis에 특이적인SNP을확인하고, 이에 대한HybProbe를 제작하여 real-time PCR 법을 개발하였고, 그 특이도와 민감도를 조사하였다. 설계된 특이probe가 존재하는 115 bp 크기의 염기 서열은 B. canis 분리주 F7/02, F7/05A,B, UK10/02, 79/85, 79/92, 79/139와 일치하는 것으로 NCBI의 BLAST 검색을 통해확인하였다. 이를토대로, real-time PCR에서B. canis 표준균주 및 분리주의 특이적인 증폭이 확인되었으며, 다른 브루셀라 균주와의 melting 온도로 재검증한 결과, matching 67℃와 mismatching 62℃ 온도로 확연히 구분되어 감별되었다.

 B. canis의 특이 probe의 genomic DNA을 이용한 검출 한계 범위는 30 ng부터 30 fg까지 정량적으로 검출 가능하였지만, 3 fg 이후는 형광값의 범위가 크게 낮아 정상적인 증폭으로 확인할 수 없었다. 이는 일반적으로 브루셀라종(species) 전체 검출에 사용되는 31-kDa Brucella abortus antigen을 encoding한 B4/B5와 out-membrane protein을 encoding한 omp-2 gene 부위의 JPF/JPR primer를 이용한 PCR 법보다 약 100배 이상 높은 민감도를 보였다 [18]. 다만, 일반 PCR 법 중 16S rRNA sequence 부위를 이용한 브루셀라 종 (species) 전체를 검출하는 F4/R2 primer는 real-time PCR과 동일한 농도에서 검출 가능하지만, 유전학적으로 유사한 토양이나 환경에 존재하는 미생물 Ochrobactrum anthropi 등과 함께 비 특이적으로 증폭되는 단점을 가지고 있다 [1].

브루셀라균은 개 혈액 내에 초기 감염일 경우 소량의 균이 잔존하고 있으므로, 이를 검출하기 위해서는 기존의 보고된 민감도 보다 높아야 한다. 따라서 본 연구는 전혈에 B. canis를 접종시켜 전혈과 buffy coat로 부터 DNA을 추출하여real-time PCR에 사용하였다. 한계 검출 범위는 전혈보다 buffy coat에서 DNA을 추출하였을때 50배 이상 민감도가 향상된 2 CFU인 것으로 확인할 수 있었다. 이것은 전혈 내 buffy coat를 추출하여 사용함으로 산술적으로 5배 농축되지만, 전혈에 함유되어 있는 각종 enzyme 등 DNA 증폭을 저해하는 물질이 상당수 제거됨으로써 민감도가 50배 이상 향상된 것으로 판단된다 [14, 17].

 따라서 buffy coat를 이용할 경우, 2 CFU까지 검출 가능함으로 개브루셀라병 진단에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단되며, 특정 개체군 감염밀도 파악에 활용할 수 있을 것이다. 또한, 개 브루셀라 발병지역의 가축방역기관에서 쉽게 활용할 수 있어 단 시간 내 정확한 진단이 가능하므로 감염 동물의 격리 및 예방적 처치 등을 통하여 사육 동물간 또는 사람으로의 전파위험 등을 줄일 수 있을 것이다.

감사의 글

 본 연구는 농림수산검역검사본부 수의과학기술개발연구사업(과제코드 : C-AD13-2010-12-01)의 지원에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

Reference

1.Al-Ajlan HH, Ibrahim AS, Al-Salamah AA. Comparison of different PCR methods for detection of Brucella spp. in human blood samples. Pol J Microbiol. 2011, 60(1) :27-33.
2.Baek BK, Park MY, Islam MA, Khatun MM, Lee SI, Boyle SM. The first detection of Brucella canis in cattle in the Republic of Korea. Zoonoses Public Health. 2012, 59(2) :77-82.
3.Boschiroli ML, Foulongne V, O'Callaghan D. Brucellosis: a worldwide zoonosis. Curr Opin Microbiol. 2001, 4(1) :58-64.
4.Bounaadja L, Albert D, Chénais B, Hénault S, Zygmunt MS, Poliak S, Garin-Bastuji B. Real-time PCR for identification of Brucella spp.: a comparative study of IS711, bcsp31 and per target genes. Vet Microbiol. 2009, 137 (1-2):156-164.
5.Corbel MJ. Brucellosis: an overview. Emerg Infect Dis. 1997, 3(2):213-221.
6.de Oliveira MZ, Vale V, Keid L, Freire SM, Meyer R, Portela RW, Barrouin-Melo SM. Validation of an ELISA method for the serological diagnosis of canine brucellosis due to Brucella canis. Res Vet Sci. 2011, 90(3) :425-431.
7.Foster G, Osterman BS, Godfroid J, Jacques I, Cloeckaert A. Brucella ceti sp. nov. and Brucella pinnipedialis sp. nov. for Brucella strains with cetaceans and seals as their preferred hosts. Int J Syst Evol Microbiol. 2007, 57(Pt 11):2688-2693.
8.Her M, Cho DH, Kang SI, Cho YS, Hwang IY, Bae YC, Yoon H, Heo YR, Jung SC, Yoo H. The development of a selective medium for the Brucella abortus strains and its comparison with the currently recommended and used medium. Diagn Microbiol Infect Dis. 2010, 67(1) :15-21.
9.Her M, Kang SI, Cho DH, Cho YS, Hwang IY, Heo YR, Jung SC, Yoo HS. Application and evaluation of the MLVA typing assay for the Brucella abortus strains isolated in Korea. BMC Microbiol. 2009, 9:230.
10.Hollett RB. Canine brucellosis: outbreaks and compliance. Theriogenology. 2006, 66(3):575-587.
11.Kang SI, Heo EJ, Cho D, Kim JW, Kim JY, Jung SC, Her M. Genetic comparison of Brucella canis isolates by the MLVA assay in South Korea. J Vet Med Sci. 2011, 73(6):779-786.
12.Kang SI, Her M, Kim JW, Kim JY, Ko KY, Ha YM, Jung SC. Advanced multiplex PCR assay for differentiation of Brucella species. Appl Environ Microbiol. 2011, 77(18):6726-6728.
13.Keid LB, Soares RM, Vasconcellos SA, Megid J, Salgado VR, Richtzenhain LJ. Comparison of agar gel immunodiffusion test, rapid slide agglutination test, microbiological culture and PCR for the diagnosis of canine brucellosis. Res Vet Sci. 2009, 86(1):22-26.
14.Keid LB, Soares RM, Vasconcellos SA, Salgado VR, Megid J, Richtzenhain LJ. Comparison of a PCR assay in whole blood and serum specimens for canine brucellosis diagnosis. Vet Rec. 2010, 167(3):96-99.
15.Kim S. The mechanism of brucellosis; virulence factors of Brucella spp. Kor J Vet Publ Hlth. 2007, 31(2) :105-114.
16.Memish ZA, Balkhy HH. Brucellosis and international travel. J Travel Med. 2004, 11(1):49-55.
17.Mitka S, Anetakis C, Souliou E, Diza E, Kansouzidou A. Evaluation of different PCR assays for early detection of acute and relapsing brucellosis in humans in comparison with conventional methods. J Clin Microbiol. 2007, 45(4):1211-1218.
18.Navarro E, Escribano J, Fernández J, Solera J. Comparison of three different PCR methods for detection of Brucella spp. in human blood samples. FEMS Immunol Med Microbiol. 2002, 34(2):147-151.
19.OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 6th ed. Office Internationaldes Épizooties, Paris, France, 2009. p. 624-659.
20.Ohtsuki R, Kawamoto K, Kato Y, Shah MM, Ezaki T, Makino SI. Rapid detection of Brucella spp. by the loop-mediated isothermal amplification method. J Appl Microbiol. 2008, 104(6):1815-1823.
21.Probert WS, Schrader KN, Khuong NY, Bystrom SL, Graves MH. Real-time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. J Clin Microbiol. 2004, 42(3):1290-1293.
22.Queipo-Ortu-o MI, Colmenero JD, Mu-oz N, Baeza G, Clavijo E, Morata P. Rapid diagnosis of Brucella epididymo- orchitis by real-time polymerase chain reaction assay in urine samples. J Urol. 2006, 176(5):2290- 2293.
23.Yoon HC, Nam HM, Kim CH, Park CK, Kang ML, Wee SH. Risk factors for bovine brucellosis in Korea: A case control study. Kor J Vet Publ Hlth. 2006, 30(1):77-87