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ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.37 No.1 pp.35-38
DOI :

Immunostimulatory effects of Bordetella bronchiseptica antigen on mouse spleen cells

Hong-Gu Joo, Yongchan Jo
College of Veterinary Medicine, Jeju National University, Jeju 690-756, Republic of Korea
Received 1 February 2013, revised 19 March 2013, accepted 21 March 2013

Abstract

Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) is a Gram negative bacterium that causes a common respiratorydisease in animals including pigs. It is a major etiological pathogen for atropic rhinitis, causing damage to the swine industry.Despite many efforts in development of an efficient vaccine against B. bronchiseptica, studies characterizing antigenicproperties of B. bronchiseptica are lacking. In this study, we investigated the intact immunogenicity of B. bronchiseptica inthe absence of vaccine adjuvant using mouse spleen cells. A preparation of formalin-treated intact B. bronchiseptica andmouse spleen cells was used for the experimental setup. The activation and viability of spleen cells treated with B.bronchiseptica was measured by MTT assay and Trypan blue exclusion test, respectively. A concentration range of B. bronchisepticagenerated some clusters of spleen cells, indicating high proliferation. For functional analysis, production of TNFalphawas measured using specific ELISA after harvest of culture supernatants and expression of lymphocyte activationmarkers (CD25, CD69) was analyzed by flow cytometry. By itself, B. bronchiseptica showed significant proliferation andfunctional enhancement of spleen cells. Taken together, the intact immunogenecity of B. bronchiseptica may affect thedevelopment of its vaccine.

07 주홍구_가편집_1교_저자+가제본.pdf812.8KB

서 론

 비장은 혈액에서 유래된 항원에 대한 면역반응이 일어나는 주요 면역기관이며, 혈액의 주요한 여과장치로써 작용하여 노화되거나, 손상된 세포를 발견하여 제거하는 기능을 한다. 비장은 백색질과 적색질로 구성되어 있고, 적혈구, 대식 세포, 수지상 세포, 림프구, 형질세포등의세포들로구성되어있으며, T 림프구는 주로 동맥 주위 림프초, B 림프구는 소포와 종자 중심(germinal center)에분포하고 있다. 이러한 면역세포들로 구성된 비장은 면역항상성 유지에중요한역할을 하는기관이다 [1]. 수지상 세포와 같은 항원제시세포에의해 림프절또는 비장의 림프구가 활성화되면 [11] 관련 cytokine인 IL-2의 수용체에 존재하는 α사슬인 CD25가 세포 표면에 다수 발현하여 [15], IL-2에 대한 림프구의 감수성이 증가하며, 림프구의 clonal expansion이 일어난다 [4, 13]. 그리고 CD25와 CD69는 림프구의 activation시 초기에 발현되는 활성화 마커이다 [14].

 Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica)는 그람음성의 호흡기 감염균으로 돼지, 개, 토끼, 고양이, 말 등 광범위한 숙주에 심각한 질병을 유발한다 [7]. Bordetella bronchiseptica는 Pasteurella multocida 등과 혼합 감염되어 성장장애위축성 비염 등 돼지에서 주요한 생산 손실을 일으키고있는 세균이다 [5]. 현재까지 B. bronchiseptica에 대한 면역 생성을 위해 다수의 백신들이 개발되어 사용 중이다 [3, 8]. 하지만 B.bronchiseptica에 대한 항원 자체의 면역원성에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 생체 내 주요 면역 세포인 비장 세포에 불활성화 시킨 B. bronchiseptica를 처리하여 B.bronchiseptica 자체의 면역원성을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물 및 균

모든 실험에 ORIENT BIO에서 구입하여 제주대학교 수의약리학실험실에서 유지된 7~12 주령의 Balb/c 마우스를 사용하였다. 동물실험은 제주대학교 동물실험 윤리위원회의 승인을 받아 시행되었으며, 제주대학교 동물실험 윤리지침을 준수하였다. B. bronchiseptica는 ㈜고려비엔피에서 제공받았으며, 포르말린으로 처리된 불활화 B. bronchiseptica 균을 사용하였다.

비장 세포의 준비 및 배양

마우스의 비장 세포를 이용해 배양하는 실험은 이미 확립된 방법에 따라 실시했다 [10]. 마우스를 안락사 시킨 후, 비장을 외과적으로 적출하였다. Phosphate buffered saline (PBS) 으로 spleen을 세척한후 분쇄하였고, 1,500 rpm에서 7분간원심분리하여 비장 세포를 분리하였다. 이 세포들을 10분간 ACK lysis buffer와반응시켜 적혈구를용혈시키고, 다시동일한조건으로 원심분리하여 적혈구가 제거된 세포를 분리하였다. 이후 T75 flask에 넣고 37℃ CO2  배양기에서 30분간 배양하여 macrophage, fibroblast 등의 불필요한 부착세포를 flask 바닥에 부착시켜 제거하고, 상층액 만을 걷어내어 floating cell (lymphocyte)을 분리하였다. 이 세포를 96-well 또는 6-well 배양용기에 2×106 cells/㎖의 농도로 배양하여 실험에 사용하였다.

비장 세포의 활성화 및 생존율, 형태 변화의 측정

 Naive spleen cell에 대한 B. bronchiseptica의 효과를 알아보기 위해 96-well plate에 비장 세포를 2×106 cells/㎖의 농도로 준비하였다. 이후 B. bronchiseptica를 2배 단계희석법으로 0~5 ㎍/㎖의 농도 범위에서 처리한 후 5일간 배양하였다. 이후3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma)을 0.5 ㎎/㎖ 농도 (10 ㎕/well)로 넣었다. 37℃ CO2 배양기에서 4시간 배양한 후, 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) 용액을well당100 ㎕씩 넣었다. 배양기에서 2시간 더 배양하고 microplate reader를 이용해 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 B. bronchiseptica가 비장 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 96-well plate에 비장 세포를 2×106 cells/㎖의 농도로 준비하였다. B. bronchiseptica를 농도 별로 처리한 뒤, trypan blue 용액으로 염색하여 live cell과 dead cell의 수를 세어 생존율을 구하였다. B. bronchiseptica 처리에 의한 세포의 외형 및 증식 양상을 관찰하기 위해 위상차 현미경을 사용하였으며, 사진 촬영하였다.

유세포분석

 Lymphocyte 증식과 활성을 알아보기 위해 비장 세포를 6-well plate에 넣은 후 (2×106 cells/㎖), B. bronchiseptica를 처리한 후 5일간 배양하였다. 처리된 세포 표면에서의 CD25와 CD69의 발현 정도를 확인하기 위해 특이항체로 염색하였으며, mitochondrial membrane potential을 이용한 cell death를 알아보기 위해 Rhodamine 123으로 세포를 염색하였다 [6]. FACSCaliburTM 을 이용해 염색된 세포들을 분석하였다 [9].

ELISA를 이용한 cytokine의 측정

 비장 세포에서 B. bronchiseptica에 의한 cytokine의 생성 변화를 알아보기 위해 ELISA를 실시하였다. Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) CytosetTM  (Invitrogen)을 이용하였으며, manufacturer's instruction을 따랐다.

결 과

B. bronchiseptica에 의한 비장 세포의 활성화와 생존율 변화

 비장 세포에 B. bronchiseptica를 각 농도마다 4개 well씩 0~5 ㎍/㎖를 처리하여 5일간 배양한 후, MTT assay를 통해 세포 활성화를 측정하고 평균을 구하였다 (Fig. 1 A). 그 결과, B. bronchiseptica를 처리한 비장 세포에서 세포 활성화 정도가 B. bronchiseptica에 의해 농도 의존적으로 증가하였음을 알 수 있었다. 세포의 생존율을 알아보기 위해 비장 세포를 96-well plate에2×106 cells/㎖의 농도로 넣은뒤, B. bronchiseptica를 처리하여 5일간 배양하였다. 그 후, 세포를 회수한 뒤 trypan blue staining solution로 염색하였고, 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 세었다 (Fig. 1 B). B. bronchiseptica의 0.313~1.25㎍/㎖ 농도 범위에서상대적으로 생존율이높았으나, 유의한 차이를 보이지는 않았다.

Fig. 1. Effects of B. bronchiseptica on the activation and viability of spleen cells. (A), MTT assay, (B), trypan blue exlusion test.

B. bronchiseptica에 의한 비장 세포의 형태 변화

 비장 세포에 B. bronchiseptica를 처리한 뒤 5일간 배양한 후 세포모습을 관찰하고 사진을 촬영하였다 (Fig. 2). B. bronchiseptica를 처리하지 않은 군 (Control, 대조군) 에 비해 B.bronchiseptica 처리군 (BB 2.5 ㎍/㎖) 에서는 증식된 cluster를 다수 확인하였다.

Fig. 2. Proliferating clusters in B. bronchiseptica-treated spleen cells.

B. bronchiseptica 처리에 의한 비장 세포의 Tumor necrosis factor-alpha 생산

 B. bronchiseptica 처리에 의한 비장 세포의 tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) 생산 변화를 보기 위해 ELISA를 실시하였다. 대조군과 비교하였을 때, B. bronchiseptica 처리군(0.313~5 ㎍/㎖)에서 저농도에서 이미 TNF-alpha의 생성이 포화된 사실을 확인할 수 있었다 (Fig. 3).

Fig. 3. TNF-alpha production in B. bronchiseptica-treated spleen cells.

B. bronchiseptica 처리에 의한 세포 표면마커 발현 및 미토콘드리아 막전위의 변화

 림프구의 활성화 마커인 CD25와 CD69 표면 마커의 발현을 평가했다. CD25는 IL-2 수용체의 알파사슬로서 림프구가 IL-2에 대해 더욱 민감하게 반응하도록 해주며, CD69는 림프구의 early-activation marker이다 [14]. B. bronchiseptica의 처리에 의해 CD25 발현이 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보인 반면, CD69의 발현은 농도 의존적이지 않았지만, 대조군에 비해 증가하였다 (Fig. 4). 또한 B. bronchiseptica의 처리군의 비장세포는 대조군에 비해 상대적으로 커진 세포의 비율이 늘어있었지만 (Fig. 5 A), 세포 자멸사의 지표 중 하나인 mitochondria membrane potential을 측정하기 위해 Rhodamine 123으로 염색한 결과, B.bronchiseptica의 처리군과 대조군 사이에 유의한 변화는 없었다 (Fig. 5 B).

Fig. 4. Enhanced expression of CD25 on spleen cells treated with B. bronchiseptica. Cells were cultured at a concentration of 5×106 cells/5 ㎖/well in 6-well culture plates. The number of histograms indicates mean fluorescence intensity of gated cells.

Fig. 5. Cell size (A) and mitochondrial membrane potential (B) of B. bronchiseptica-treated spleen cells. In B, the number of histograms indicates mean fluorescence intensity of gated cells.

고 찰

 본 연구에서는 B. bronchiseptica가 비장 세포에 미치는 영향에 대해 알아보았다. MTT assay 결과, B. bronchiseptica는 농도의존적으로 비장 세포의 활성화를 유의하게증가시켰다. 하지만 Trypan blue exclusion test에서는 비장 세포의 생존율은 크게 변화가 없음을 확인할 수 있었다. 이는 비장 세포가 B. bronchiseptica에 의해 농도 의존적으로 활성화되면서도 살아있는 세포와 죽은 세포의 비율이 비슷한 상황인 것으로 판단된다. 이는 B. bronchiseptica를 처리한 후 현미경으로 비장 세포의 형태를 관찰했을때 대조군에 비해 B. bronchiseptica 처리된 군의 비장세포에서 cluster 수가 증가한 사실과 연관된다. 면역 세포의 cluster의 형성은 세포 표면 분자 중, 특히 부착분자의 변화가 있을 때 관찰되며, 효율적인 면역반응의 지표로써 사용되고 있다. 이를 통해 포르말린으로 불활화 된 B. bronchiseptica가 비장세포에 독성은 증가시키지 않으면서 활성화시킬수 있다는 사실을 확인하였다.

 TNF-alpha의 양을 측정한 결과, 상대적으로 저농도의 B. bronchiseptica에서도 포화된 TNF-alpha의 생산량을 확인할 수 있었다. TNF-alpha는 활성화 된 T-cell 혹은 대식 세포에 의해 생산 분비되는 염증 관련 대표 cytokine이며, 백신 효능을 일으키는데 필수적이다. 백신은 주로 백신항원과 어쥬번트로 구성되어 있는데, 염증성 cytokine의 생산 유도가 어쥬번트의 주요 역할중하나이다[2]. 따라서 불활화된 B. bronchiseptica 균자체가 염증성 cytokine을 생산할 수 있다는 사실은 백신 제조 시, 어쥬번트의 사용에 신중해야 함을 의미한다. 유세포 분석을 실시한 결과 B. bronchiseptica가 IL-2 수용체의 알파사슬인 CD25의 표면 발현을 농도의존적으로 증가시키는 사실을 확인했다. 이는 B. bronchiseptica로 처리된 비장 세포가 IL-2에 민감하게 작용하여 clonal expansion할 수 있는 가능성을 보여주는 것이다 [12, 15]. 반면, 비장 세포의 초기 활성화 정도를 알아보는 마커인 CD69의 발현은 B. bronchiseptica가 처리된 비장 세포에서 증가하였지만, 농도 의존적이지 않았다. 세포 자멸사 시에는 미토콘드리아의 막전위가 감소한다. 이를 확인하기 위해 Rhodamine 123으로 염색한 대조군과 B. bronchiseptica 처리군 사이에 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 이는 생존율에서 별다른 변화가 없었던 사실과 유사한 결과로 판단된다. 향후 연구를 통해 B. bronchiseptica가 비장의 어떤 특정한 면역 세포에 영향을 끼치는 지 세부적인 연구가 필요하다

 결론적으로, 포르말린 처리된 B. bronchiseptica는 자체적으로비장세포를활성화시킨다. 이는기존에사용중인 백신어쥬번트의 적절성, 최적의 조합 등의 연구를 통해 새롭고 효과적인 B. bronchiseptica 백신 개발의 가능성을 제시하는 것이다. 향후 연구를통해산업동물 현장특히 양돈산업에서의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

감사의 글

이 논문은 2013학년도 제주대학교학술진흥연구비 지원사업에 의하여 연구되었음.

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