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ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.36 No.2 pp.66-74
DOI :

Efficacy of specific immunoglobulin egg yolk (IgY) against enterotoxigenic Escherichia coli K99, Salmonella Typhimurium and Salmonella Choleraesuis

Tae-Wook Hahn2,†, Bo-Mi Kim1, Chong-Hae Hong2
2College of Veterinary Medicine and Institution of Veterinary Science, Kangwon National University
1ADbiotech, Chunchen
Received June 07, 2012, Revised June 22, 2012, Accepted June 26, 2012

Abstract

Egg yolk immunoglobulin (IgY) is the antibody in egg yolk and can be produced in egg yolk by immunizing henswith antigens. IgY is functionally equivalent to mammalian IgG. It is found in the serum of the chicken and is passedfrom the mother chicken to the embryo via the egg yolk, a process that results in a high concentration of IgY in theegg yolk. The objective of this study was to evaluate the efficacy of specific IgY against enterotoxigenic Escherichiacoli (ETEC) K99, Salmonella Typhimurium and Salmonella Choleraesuis that cause porcine bacterial diseases. Toprepare specific IgY, Hy-Line Brown chickens were vaccinated with killed vaccine complex including E. coli K99, S.Typhimurium and S. Choleraesuis. The chicken egg yolk antibodies were purified from egg yolk by ammonium sulfateprecipitation and the quality of the final preparation was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE). Titres of specific IgY in final preparations were measured by an enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA). Antibody titers peaked at 3 weeks regardless the bacterial types and the similar patterns of immuneresponse were observed for respective pathogens. In growth inhibitor test, specific IgY showed inhibitory effect onbacterial growth. After 0, 3, 6 and 12 hour of incubation with specific IgY (100 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖), there wasa significant decrease in the growth (A600nm) of E. coli K99, S. Typhimurium and S. Choleraesuis compared to nonspecificIgY and controls. In BALB/c mice, the effect of specific IgY (100 ㎎/㎏, 250 ㎎/㎏) on bacterial challenges wasinvestigated by intramuscular injection and oral administration of bacteria. Mice treated with specific IgY showed highsurvival rate though there was no significant differences on blood biochemichal examinations between treated anduntreated groups. These results indicate the potential of specific IgY for the treatment of porcine bacterial diseases causedby E. coli K99, S. Typhimurium and S. Choleraesuis.

서 론

살모넬라 속균은 사람과 동물의 장관에 분포하는 장내세균으로서 어린 돼지에서는 패혈증, 설사, 장염 등을 유발할 수 있을 뿐만 아니라, 이차적인 감염을 유도하여 폐사를 일으킬 가능성이 높다. 또한, 성돈에서는 보균돈이 많아 질병전파의 매개체 역할을 하고, 식육 및 환경오염의 원인이 되기도 한다 [10]. 자돈 살모넬라 감염증의 주요 원인균인 Salmonella Typhimurium과 Salmonella Choleraesuis는 편모에 의해 장관, 장내 상피세포를 침투하여 설사 및 탈수증상을 일으킨다 [10]. S. Typhimurium을 포함한 살모넬라 병원체는 양돈농가에 상당한 경제적 피해를 일으키는 세균이자 농림수산식품부에서 법정 가축전염병 중 15 종의 인수공통 전염병에 포함되는 질병을 유발하며, 이 세균의 식육 내 감염은 의한 공중보건학적으로 커다란 문제가 되고 있다 [9]. 살모넬라의 경우, 그 종 속에 대한 혈청형이 너무 많고 혈청형간 교차 방어가 잘 이루어지지 않아 백신으로 예방하는 것은 한계가 있다. 현재 살모넬라가 일으키는 질병에 대해 항생제를 사용하여 치료하고 있으나, 투약을 중단하면 국소림프절에 잠적해 있던 세균이 재활동하는 등의 문제점이 있다 [24]. Enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC) K99는 어린 돼지나 송아지의 설사를 유발시키는 장관 독성 대장균으로 분류되며, 어린 동물의 소장 점막 상피세포에 정착을 한 후 독소를 분비하여 숙주의 연동운동, 점액분비와 융모운동을 방해함으로써 설사를 유발시키는 것으로 알려져 있다 [12]. 대장균은 어린 돼지의 경우, 국내에서 유행하는 혈청형의 대장균 및 병원성 인자를 함유하는 백신을 제조하여 임신모돈에게 주사하고, 분만 후 초유를 통하여 모체에서 형성된 항체를 전달함으로써 질병을 예방하는 시도가 일반적이지만, 임신모돈의 상태에 따라 항체 생성수준 정도의 개체별 차이가 크고 초유를 통한 모체이행 항체에 의한 면역 유지기간이 짧으며, 이유시까지 자돈에게 충분한 방어력을 제공하지 못한다는 보고가 있다 [30]. 최근 소비자들의 먹을 거리에 대한 안전성 인식이 높아짐으로 인해 축산물에 함유될 수 있는 항생제 규제가 강화되고, 항생제를 대체하여 질병을 예방할 수 있는 백신, 생균제 및 천연물 등에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 하지만, 백신접종에 의한 쇼크, 개체 당 접종을 하는 작업의 비효율성 등의 문제점이 나타나 점차 새로운 예방 및 치료 방법이 요구되면서 이를 대처하는 방안으로 난황항체(immunoglobulin egg yolk: IgY)를 이용하는 연구가 활발히 진행되었다. [14, 24, 25, 30].

난황항체는 포유류의 IgG와 유사하나, 단백질 구조상의 차이로 인해 구별되며, 난황 유래의 항체이므로 난황항체라 칭한다 [15]. 병아리는 난황을 통해 어미로부터 항체를 받아 계란 내에서나 외부에서 작용하는 병원체을 무력화 시키게 된다. 이처럼, 산란계에 각종 병원체를 접종함으로써 면역항체가 높은 계란을 손쉽게 생산할 수 있다 [14]. 또한 난황항체는 포유동물 혈청으로부터 IgG를 얻는 것에 비해서 계란으로부터 항체를 얻기 때문에 기술적 및 경제적으로 이점을 가지고 있고, 동물친화적인 방법이기 때문에 동물보호차원에서의 규정이나 법규에 잘 부합된다. 또한, 닭의 면역 반응은 2번의 백신접종을 통해 20 주 이상 지속되어 오랜 기간 항체를 획득할 수 있으며, 한 개의 계란에는 120 ㎎ 정도의 많은 양의 난황항체를 포함하고 있어, 동물의 감염성 질병에 대한 면역증강물질을 효율적으로 생산할 수 있다. 이러한 장점으로 인해 난황항체는 인간과 동물에서 전염성장 질환을 치료하기 위한 수동면역 치료요법으로 널리 사용되고 있으며, 생물의학 연구나 진단의학 분야에서 면역학적 도구로 이용되고 있다 [7].

본 연구는 세균성 질병을 예방하는 천연 면역물질 개발을 통해 안전한 축산물 생산에 기여하고자 양돈의 소화기성 질병을 유발하는 대장균과 살모넬라에 대한 특이난황항체를 생산하였다. In vitro 실험을 통하여 이 특이난황항체의 세균 증식 억제 능력을 평가하였고, in vivo 실험으로 마우스에 세균의 공격 접종을 통해서 특이난황항체 투여구와 비투여구의 폐사율, 혈액학적 분석을 통하여 특이난황항체의 병변의 발생 억제 효과를 조사하여 그 효능을 평가하였다.

재료 및 방법

1. 실험 동물

난황항체 생산을 위해 22주령 된 산란계(Hy-Line Brown)를 사용하였으며, 난황항체의 방어효과를 조사하기 위한 실험동물로는 (주)코아텍에서 구입한 5주령 BALB/c mouse (18~20 g) 암컷을 사용하였다.

2. 균주 배양 및 백신 생산

E. coli K99(KCTC 2617), S. Typhimurium(KCTC 2054)과 S. Choleraesuis(KCTC 12399)를 미생물 자원센터에서 분양받아 Brain Heart Infusion agar(BHI agar, Difco, USA)를 사용하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 집락 형성을 확인 후 형성된 집락을 BHI 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 진탕배양 후 0.3% formalin으로 12시간 실온에서 불활화시켰다. 불활화 시킨 배양액을 원심분리(9,000 rpm, 4℃, 15 min)하여 균체를 회수한 뒤 spectrophotometer(Beckman, USA)를 이용하여 410 nm에서 optical density(OD) 1.0으로 농도를 맞추었다. 불활화된 3가지 균액을 동량으로 합친 후 항원과 오일 ISA 70 adjvant(Seppic, France)를 약 3:7 비율로 혼합한 후 균질화 시킨 다음 살모넬라와 대장균의 혼합백신을 준비하였다.

3. 난황항체의 대량 생산

1) 면역방법

제조된 백신을 22 주령된 산란계(Hy-Line Brown)에 0.8 ㎖씩 가슴근육에 3주 간격으로 3회 주사하였다. 1차 접종 이후부터 3차 접종 기간 동안 7일 간격으로 계란을 수거하여 난황을 분리한 뒤 각 균주에 대한 특이난황 항체가를 아래에 기술된 방법에 의해 확인하였다.

2) 특이난황항체의 추출 및 확인

면역된 산란계로부터 생산된 계란에서의 난황항체 분리는 ammonium sulfate 정제법에 따라 실시하였다 [24]. 즉, 난황과 증류수를 1:10의 비율로 고르게 혼합하고, -20℃에 2 일간 냉동시킨 후 해동하여 원심분리(7,000 rpm, 4℃, 20 min) 한 뒤 filter paper(Whatman, Germany)를 이용하여 수용성 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질에 35% ammonium sulfate(Sigma)를 첨가하여 단백질만을 순수하게 침전시킨 후 수거하였다. 수거한 난황항체는 sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 이용하여 전기영동을 실시하였으며, 전기영동 후 gel을 coomassie brilliant blue R-250(Sigma)를 이용하여 분리된 IgY를 확인하였다.

4. 특이난황항체의 측정

난황의 항체는 기존의 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 측정하였다 [19]. ELISA 항원으로는 E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Choleraesuis의 outer membrane protein(OMP)를 기존에 보고한 방법에 의해 추출하여 사용하였다 [12, 24]. 추출한 OMP를 coating buffer(0.1 M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6, Sigma)에 희석하여 96 well microplate well당 0.1 ㎍/㎖의 OMP를 100 ㎕씩 분주하여 4℃에서 18시간 코팅시킨 후, PBS-T(phosphate buffer saline, 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 3 회 세척한 다음 bovine serum albumin(BSA, Sigma)이 함유된 blocking buffer를 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1 시간동안 blocking 시켰다. 그 후 같은 방법으로 세척한 뒤, 앞서 수거한 난황을 희석한 뒤 각 well에 100 ㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응하지 않은 항체는 PBS-T로 3회 세척함으로써 제거하였고, 2차 항체(anti-chicken IgG, Sigma)를 1% BSA buffer에 1:50,000으로 희석하여 각 well에 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에 1시간 반응시켰다. 그 후 3번 세척을 하고 tetrametyl benzidine(TMB, KPL, Korea)를 각 well에 100 ㎕씩 분주한 다음 실온에서 약 10 분간 반응시키고 stop solution(1.6 N H2SO4)을 100 ㎕ 분주하여 반응을 정지시키고, microplate ELISA reader(Tecan, Swiss)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5. 난황항체 효능시험

1) 항균력 시험

일반 난황항체와 특이난황항체를 100 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖의 농도로 희석한 후 3가지 세균의 증식을 억제하는 효과를 비교 시험하였다. McFarland standard solution(Bio-Mérieux)를 사용하여 면역화 시킬 때 사용된 E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Choleraesuis를 각 1×106 colony forming unit(cfu)/㎖로 맞추었다. BHI broth 9 ㎖에 각 균체를 100 ㎕씩 접종하고, 특이난황항체의 농도별로 접종한 뒤 37℃에서 진탕배양하면서 0, 3, 6 그리고 12시간동안 배양액을 채취하여 600 nm에서 흡광도를 측정하면서 세균의 증식에 작용하는 특이난황항체의 항균 능력을 확인하였다.

2) 마우스 공격접종 시험

E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Choleraesuis의 공격 접종에 대한 특이난황항체의 효과를 확인하기 위해 특이난 황항체를 먼저 마우스에 투여한 후 1 시간 뒤에 각 균체를 마우스에 접종하여 감염시키고, 매일 특이난황항체를 투여하면서 폐사율을 관찰하였다. 특이난황항체를 100 ㎎/㎏과 250 ㎎/㎏의 용량으로 경구로 투여한 처리군과 복강으로 투여한 처리군으로 나누어 시험기간 내 매일 투여하였고, 공격 접종은 특이난황항체를 1 회 투여 후 1시간 뒤 E. coli K99, S. Typhimurium 그리고 S. Choleraesuis를 1×104 CFU/㎖ 농도로 혼합하여 복강으로 1 회 접종하였다.

3) 혈액학적인 검사

마우스의 안와채혈을 통하여 얻어진 혈액을 항응고제 처리가 되어 있는 튜브에 보관하여 응고되지 않게 한 후 동물용 자동혈구계산기(Hemavet 950, USA)를 이용하여 white blood cell(WBC), neutrophil(NE), lymphocyte(LY), monocyte(MO), eosinophil(EO), basophil(BA)을 각각 측정하였다.

6. 통계처리

통계처리는 Prism 4.0(GraphPad software Inc., USA) 프로그램을 이용하였으며, 데이터는 Mean±S.E.M으로 표시하였고 p<0.05 이하의 값을 유의성이 있다고 판단하였으며, ANOVA test를 시행하였다.

결 과

1. 면역난황항체(IgY)의 확인

Ammonium sulfate 정제법을 이용하여 난황항체를 분리한 뒤, SDS-PAGE상에서 확인한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 보는 바와 같이 72 kDa에서의 heavy chain과 25 kDa 부근에서 light chain이 확인되어 난황항체의 순수 분리가 이루어졌음을 확인하였다.

Fig. 1. SDS-PAGE pattern of IgY purified by ammonium sulfate fractionation. Purified protein sample was stained with Coomassie brilliant blue R-250. M: molecular mass standards, I; purified IgY.

2. E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Choleraesuis 혼합 항원의 특이난황 항체의 확인

세균의 혼합백신 접종에 의해 면역된 산란계에서 얻은 계란의 난황항체를 E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Chole-raesuis에서 추출한 OMP로 각각 코팅한 ELISA로 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 각 항원에 대한 항체가 1차 접종 후 2주차부터 대조군과 차이를 보이며 급격히 증가하기 시작하였고, 2차 접종 이후부터 3차 접종기간 동안 증가된 높은 항체가가 유지되었다. 그러나 항원간의 항체가에 대한 차이는 없었다. 이 결과를 통해 백신을 접종하지 않은 대조군에 비하여 혼합백신의 접종을 통해 각각의 항원에 대한 특이적인 난황항체를 확인할 수 있었고, 1차 접종을 통해 형성된 고역가의 특이 항체는 2차 백신접종을 통해 그 역가가 꾸준히 유지된 것을 확인하였다.

Fig. 2. Antibody titers of IgY from hens immunized with antigens of E. coli K99, S. Typhimurium and S. Choleraesuis until 42 days post vaccination.

3. 난황항체 효능 시험

1) 항균력 시험 결과

E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Choleraesuis를 BHI broth에 접종한 후 혼합백신을 접종하지 않은 닭의 계란에서 추출한 난황항체와 혼합백신을 접종한 산란계 계란에서 추출한 특이난황항체를 각각 100 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖ 농도별로 접종하여 배양시간에 따른 탁도 변화를 Fig. 3에 나타내었다. E. coli K99에 대한 특이난황항체의 증식 억제 효과는 Fig. 3(a)에서 볼 수 있듯이 IgY와 세균을 섞은 후 3시간 배양까지 일반난황항체의 대조군과 특이난황항체 처리군 간의 OD값의 차이는 없었다. 그러나 배양 6시간 후 특이난황항체 처리군에서 대조군에 비하여 탁도가 감소하는 것을 확인하였고, 특이난황항체의 농도가 높을수록 세균의 증식억제 능력이 높아지는 것을 확인하였다. S. Typhi-murium은 Fig. 3(b)에 나타내었다. 배양 3시간 후부터 특이 난황항체에 의해 증식억제가 나타났고, 6시간 이후에서부터 대조군에 비하여 특이난황항체에 의한 S. Typhimurium의 증식억제가 배양 12시간까지도 지속되는 것이 관찰되었다. 하지만 특이난황항체 100 ㎍/㎖의 농도에서는 배양 9시간 이후부터 탁도가 증가하면서 12시간 측정 결과, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖ 처리군과 뚜렷한 차이를 보이는 것으로 나타나 특이난황항체가 S. Typhimurium의 증식을 효과적으로 억제하지 못했다. S. Choleraseuis의 결과는 Fig. 3.(c)에서 확인할 수 있듯이 E. coli K99 처리군과 마찬가지로 배양 3시간째에는 별 차이가 없었으나, 6시간 배양 이후 특이난황항체에 의해 증식이 억제되기 시작하여 12시간동안 지속되는 것이 관찰되었다. 일반항체는 동일 농도별로 투여한 처리군에서 E. coli K99, S. Typhimurium 및 S. Choleraesuis의 증식을 억제시키지 못하는 것으로 나타났다.

Fig. 3. The effect of IgY on the growth of E. coli K99 (A), S. Typhimurium (B) and S. Choleraesuis (C). Bacteria (1×106 CFU/㎖) were treated with specific IgY or nonspecific IgY and grown in Brain Heart Infusion broth at 37℃ with shaking.

2) 공격 접종 시험 결과

특이난황항체를 마우스에 각 100 ㎎/㎏과 250 ㎎/㎏ 농도로 투여하고, 1시간 뒤에 E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Choleraesuis 혼합 균주를 1×104 cfu/㎖의 농도로 접종한 후 매일 특이난황항체를 기술된 용량과 경로로 투여하면서 14일간 폐사율을 관찰하였다. 병원성 세균의 투여로 인해 2일째부터 폐사하는 개체가 나왔으며, 시험 종료 시 특이난황항체를 투여하지 않고 병원균만을 접종한 대조군은 10%의 생존율을 나타냈다. 특이난황항체 250 ㎎/㎏으로 경구투여와 복강투여 처리군은 각각 40%와 50%의 생존율을 보였다. 특이난황항체를 100 ㎎/㎏으로 경구투여와 복강투여 처리군에서는 4일째 모든 개체가 사망하여 오히려 대조군보다 생존율이 낮았다(Fig. 4).

Fig. 4. The effect of IgY on the survival rate after the challenge with E. coli K99, S. Typhimurium and S. Choleraesuis. Mice were challenged with bacteria (1×104 CFU/㎖) with or without specific IgY.

3) 혈액학적인 측정 결과

E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Choleraesuis 3종의 병원성 세균 공격 접종에 의한 혈액 내 면역세포의 변화를 알아보기 위하여 공격접종 14일 후 살아있는 개체의 혈액을 채취하고 각각의 혈액세포의 수를 측정하였다.

Table 1의 결과를 보게 되면 대조군에 비하여 공격접종군은 감염에 따라 혈액 내 호중구(NE)의 수와 호산구(EO)의 수가 증가하였고, 림프구(LY), 단핵구(MO) 그리고 호염구(BA)에서는 차이를 보이지 않았다. 대조군과 250 ㎎/㎏의 농도로 특이난황항체를 투여한 뒤 공격접종한 처리군에서도 호중구(NE)의 수와 호산구(EO)의 수가 비교적 높아 공격접종에 의한 감염을 확인하였다.

Table 1. Results of hematological analysis in mice after bacterial challenge

고 찰

특이난황항체는 특정 항체의 결합을 통해 병원성 미생물을 감소시키거나 억제시킨다는 보고 [7, 12, 30]에 따라 양돈 산업에 있어 주요 세균성 질병의 원인균인 E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Choleraesuis의 혼합백신을 제조하여 산란계에 접종한 뒤, 생산된 계란에서 특이난황항체를 추출, 정제하였고, 특이난황항체가 갖는 각 세균에 대한 증식억제능력과 마우스에서 공격접종을 통해 세균감염에 대한 방어 능력을 조사하였다.

난황항체를 제조할 때 각각의 병원체를 단독으로 산란계에 접종하는 것보다 병원체를 혼합해서 제조한 혼합백신을 접종하여 난황항체를 생산하는 것이 일반적이 방법으로 보고되고 있다. 난황항체를 이용한 돼지 호흡기성 세균성 전염병의 방어의 경우에서 파스튜렐라성 폐렴 및 흉막폐렴에 대한 난황항체 생산 시 불활화시킨 P. multocida와 A. pleuropneumoniae를 복합 투여하는 경우가 초기면역형성 및 항체가 상승에 더 효과적이었고 [26], 또한 살모넬라 편모항원에 대한 난황항체의 생산에서도 서로 다른 살모넬라 혈청형인 S. Choleraesuis와 S. Typhisuis를 복합투여 후 얻은 난황항체에서 항원간의 간섭작용 없이 각각의 특이항체 형성을 확인할 수 있었다 [24, 33]. 이와 같이, 본 연구에서 제조된 E. coli K99, S. Typhimurium과 S. Choleraesuis의 특이난황항체는 ELISA를 통해 각각의 세균 병원체에 대해 특이항체를 확인함으로써 난황항체를 생산하는 대상의 병원체를 혼합 접종하였을 때 각각의 세균에 대한 특이항체가 고르게 동일한 기간에 형성된다는 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 3가지 세균을 혼합한 백신에 다른 세균성 질병을 일으키는 항원을 추가하여 항체를 생산한다면 같은 작업량의 백신접종 프로그램을 이용하여 더욱 다양한 질병을 방어할 수 있는 복합특이난황항체를 효율적으로 생산할 수 있을 것이라 생각되어진다.

Lee 등은 S. Enteritidis와 S. Typhimurium에 대해 생산한 특이난황항체를 20 ㎎/㎖ 농도로 접종하고 배양하였을 때 세균의 식을 완전히 억제시켰으며, 1 ㎎/㎖의 농도에서 도 일반난황항체를 20 ㎎/㎖ 반응시킨 결과에 비하여 세균증식을 억제시킨다고 보고하였다 [17]. 동일한 종류의 세균으로 제조한 난황항체에 대한 다른 연구에서는 특이난황항체의 농도를 125 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖ 농도로 각각의 세균에 접종하고 배양한 결과, 250 ㎍/㎖의 농도에서부터 세균의 증식이 억제되는 것이 조사되었다 [2]. 본 연구에서는 각 100 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖ 농도로 각각의 세균에 반응시킨 결과에서 세균의 증식을 완전히 억제시키지는 못하였지만, 기존의 보고에 비하여 낮은 농도에서 그 효과를 관찰할 수 있었다. 이와 같이 동일한 종류의 세균에 대한 증식억제를 보이는 난황항체의 농도가 다른 것은 보통 난황항체농도를 단백질 기준으로 정량을 하고 해당 세균에 대한 특이적인 난황항체의 농도는 정량적 산출이 어렵기 때문에, 세균의 증식을 억제할 수 있는 실제 난황항체의 농도가 다르게 나타날 수 있다. 이러한 차이는 항체를 생산하는 과정에서 접종백신의 항원농도와 접종횟수에 따른 항체형성이 영향을 미쳤을 가능성이 있고, 또한 항체형성에 따른 집란시기와 기간에 따라 다를 수 있다고 생각되어진다. 따라서 본 연구에서 생산한 특이난황항체는 접종한 백신 내 고농도의 항원량이 포함되어 있었으며, 백신접종 기간에 7일 간격으로 ELISA 시험법을 통하여 해당 세균에 대한 항체형성 패턴을 분석함으로써 기존 연구에 비하여 특이항체의 함량이 높은 난황항체를 생산한 것으로 보여진다.

 병원균에 대한 난황항체의 수동면역 방어능 효과에 대한 선행연구 결과에 따르면 돼지 호흡기질병을 유발하는 B. bronchiseptica, P. multocida 3A와 4D 및 A pleuropneumoniae serotype 2에 대한 특이난황항체를 마우스에 투여 후 각 4종 세균을 선행 실험을 통하여 각각 다른 minimum lethal dose(MLD) 농도로 감염시킨 결과, 난황항체의 농도 100 ㎎/㎖이상에서 방어효과를 나타내기 시작하였고 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖ 및 400 ㎎/㎖로 농도가 증가함에 따라 방어효과가 비례하는 것으로 나타났다 [26]. 본 연구에서는 마우스에 특이난 황항체를 투여하고 3 가지 세균을 혼합하여 공격접종시킨 다음 경구와 복강으로 각각 100 ㎎/㎏, 250 ㎎/㎏ 농도의 방어능을 조사한 결과, 100 ㎎/㎏의 농도에서는 방어 효과를 보이지 않았으나, 특이난황항체 250 ㎎/㎏의 농도에서 방어능을 갖는 것을 확인하였다. 100 ㎎/㎏에서는 효과가 없고 250 ㎎/㎏의 농도에서는 효과가 있는 것은 본 연구에서 제조한 난황항체가 각 병원체에 대한 특이적인 항체의 양이 다소 적은 것이 하나의 이유로 들 수 있다. 또한 본 연구에서 특이난황 항체 100 ㎎/㎏의 농도 처리군 개체가 모두 사망한 결과는 세균의 혼합접종 대한 감염량의 설정이 사전에 확립되지 않았고, 세균 종에 관계없이 동일한 농도로 접종하였기 때문에 효과적인 농도설정이 미흡한 것으로 판단된다. 공격접종 후 생존한 마우스에서의 혈액학적 양상을 보면 대조군의 경우, 백혈구 및 6종류의 백혈구가 거의 정상수치를 나타낸 반면에, 공격접종군에서 생존한 마우스의 경우 대조군에 비해 호중구가 높은 수치를 나타냈고, 난황항체를 투여하고 공격접종 후 생존한 마우스에서도 대조군에 비해 호중구의 수치가 높게 나타났다. 이러한 호중구의 증가는 세균 감염이 일어났음을 확증하는 것이고, 생존한 마우스의 경우 투여한 난황항체가 공격접종된 균에 방어효과를 나타낸 것으로 판단된다. 또한 마우스는 목적동물이 아니고 강제투여로 인한 감염경로가 실제 감염경로와 상이할 수 있으므로 목적 동물인 돼지에서의 실험이 추가로 이루어지는 것이 필요하다. 복강 내 투여가 경구투여에 비하여 생존율이 높은 결과에 따르면 특이난황항체를 제품화 하여 경구로 급여하였을 때 소화효소에 의한 항체의 분해와 위 내 낮은 pH에 의한 항체의 변성이 우려된다. 기존 보고에서는 난황액에 플락토올리고당을 0~50% 농도의 범위에서 단계적으로 혼합하여 pH 3조건에서 2시간 동안 처리하였을 때, 당을 처리하지 않은 난황은 대조군에 비하여 상대적 잔존 항체가가 45%에 그쳤지만, 플락토올리고당을 50% 혼합한 난황의 항체가는 처리군에서 98%로 대조군와 비슷한 활성을 유지하여 플락토올리고당이 산에 대한 난황항체의 안정성에 효과적이라는 결과를 보였다 [18]. 플락토올리고당은 실온에서 산에 대해 상당히 안정하고 [11], 앞선 연구에서 확인할 수 있듯이 난황항체의 변성을 일으키지 않기 때문에, 특이난황항체 분말을 생산할 때 플락토올리고당을 첨가하여 온도와 기타 환경적인 요인에 의한 항체의 안정성에 대한 특허가 출원되어 산업화에 이용하고 있고, 소화효소에 대한 안정성을 높이기 위해 코팅기술을 접목시키는 연구가 진행 중이다. 따라서 양돈 소화기성 질병을 예방하는 특이난황항체의 폭넓은 이용을 위해서는 병원성 인자를 방어하는 환경 내에서 안정성을 유지함으로써 효과를 극대화시키기 위한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것이다.

본 연구는 산란계에 복합항원을 접종하고 각각의 세균에 효율적으로 생산된 특이난황항체를 이용하여 in vitro와 in vivo 시험을 통해 세균의 증식을 직접적으로 억제하는 특이 항체의 농도와 마우스에 세균을 감염시킨 뒤 방어능력을 보이는 효능을 조사하였다. 따라서 세균성 질병에 대한 천연면역물질로써 다양한 이용 가능성이 확인된 특이난황항체는 세균의 증식과 감염을 억제하는 농도 설정 범위를 넓히는 시험과 목적 동물에 대한 사양시험이 추가적으로 이루어진다면 양돈 세균성 질병에 대한 예방제제로써 매우 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

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