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ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.36 No.2 pp.102-107
DOI :

Establishment of porcine embryonic stem cells from parthenogenetically activated blastocysts

Sang-Ho Cha1,†, Soo-Kyung Jung1, Hyun-Jung Kim1, Eun-Song Lee3, Jeong-Mook Lim2, Eun-Jin Choi1, Hee-Soo Lee1, Kyung-Bong Koh1, Jae-Young Song1, Kyung-Woo Lee1
1Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency
2WCU Biomodulation and Department of Agricultural Biotechnology, Seoul National University, 3School of Veterinary Medicine, Kangwon National University
Received April 25, 2012, Revised June 07, 2012, Accepted June 11, 2012

Abstract

Porcine has been known to have a great impact on the studies of organ transplantation, biomaterial production andspecific biomodel development such as transgenic animals. To achieve such therapeutic purposes, establishment ofporcine embryonic stem cells (pESCs) will be needed. Especially, in vitro differentiation toward neural cells from pESCscan be a useful tool for the study of early neural development and neurodegenerative disorders. In addition, these cellscan also be used in cell replacement therapies and drug development for neuroprotective and/or neurotoxic reagents.Although several studies reported the successful isolation of pES-like cells, it has been a big challenge to determineoptimal conditions to generate pESCs without loss of pluripotency for a long time. The present study was performedfor generation and characterization of putative pESCs, and differentiation into neurons and astrocytes. In this study,porcine blastocysts were produced by parthenogenetically activated oocytes. The putative pESCs were cultured in pESCgrowth media supplemented with a growth factor and cytokines (bFGF, LIF and SCF). Subculture of pESCs wasconducted by mechanical dissociation using syringe needles after 4~5 days of incubation. As results, six putative pESClines were maintained over thirty passages. The putative pESCs were compact, round, flat, and single layered, whichwere similar to human embryonic stem cell morphologically. Six pES-like cells were positive for alkaline phosphataseactivity at every three passages. Furthermore, Oct-3/4, Sox-2, Nanog and SSEA-4 were shown to be expressed in thosecells. Also, normal karyotypes of pESCs were observed by Giemsa-staining. Differentiation potential into the three germlayers of the putative pESCs was demonstrated by the formation of embryoid bodies (EB). Besides, the study of ESCis very important in aspect of its application to not only the cell-based replacement therapies but also cellular differentiationresearch. Our results also showed that RA and N2 supplements activated the neural differentiation in pESCs.Neurofilament-160 were expressed in neural precursor cells. The expression of markers for specific neural lineages, suchas Microtubule-associated protein-2 expressed in matured neuron, was also induced from embryonic neural progenitors.In summary, the pESCs were generated from the parthenogenetically activated blastocysts and the typical characteristics of the cells were maintained for the long term culture. Furthermore, it was successful to differentiate the pESCs intovarious neural lineages through in vitro neurogenesis system. Eventually, pESCs will be excellent biomedicine inincurable and/or zoonotic diseases by regenerating the damaged tissue.

08 12-17 차상호.pdf3.95MB

서 론

줄기세포(stem cell)는 활성된 난자로부터 유도되어지는 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)와 성숙된 조직으로부터 유도되어지는 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다 [24]. 배아줄기세포는 신체를 이루는 230 종류의 특화된 모든 세포로의 분화가 가능하지만 [29], 성체줄기세포는 그것이 유래된 조직을 구성하는 세포들로만 분화할 수 있는 제한성이 있다 [2, 8].

때문에 전형성능(pluripotency)을 가진 배아줄기세포는 현대의학기술로는 치료할 수 없는 난치병 치료를 위한 잠재적인 생체치료제로서 기대되어짐은 물론, 날로 심각해져가는 인수공통전염병으로부터의 생체 방어와 치료를 위한 연구개발에 좋은 적용제가 될 것이다 [2]. 하지만, 이러한 배아줄기 세포의 희망적인 이점에도 불구하고, 아직까지 줄기세포에 대한 폭넓은 이해와 적용이 매우 제한적인 까닭은, 배아 사용에 대한 윤리적인 문제점과 더불어 줄기세포의 세포생물학적 메커니즘 규명이 확실시 되어지지 않고 있기 때문이다 [4].

줄기세포 연구의 시작은 안정적이고 확실한 줄기세포를 확보하는 것에서부터 시작된다. 사람과 생리학적으로 그리고 해부학적으로 비슷한 특징을 가지고 있는 돼지는 이미 이종장기이식분야 및 생물공학기법을 통한 생체의약품(biomedicine)의 이용으로 연구가치가 크다 [6]. 지난 20년 동안, 돼지배아줄기세포를 얻으려는 노력은 계속 되어져 왔지만, 체외배양 중 자기재생력(self-renewal)을 잃어버리고 사멸되거나 원하지 않는 세포종으로 분화되어 버리는 경우가 많았고, 극히 일부의 연구 보고에 따르면, 미분화능을 가진 돼지배아 줄기세포를 확보하더라도 지속적인 체외배양이 어려운 사례가 많았다 [3, 9, 26]. 따라서 본 실험에서는, 생명윤리에 위배되지 않는 연구기법을 통해 자기재생력(self-renewal)을 갖춘 돼지배아줄기세포를 확보하고, 이들 줄기세포로부터 특화된 세포로의 분화를 성공시킨 사례를 소개하고자 한다. 

배아줄기세포를 유도하기 위한 난자 활성화 방법에는 동결보존된 정자를 이용하여 시험관 내에서 수정시키는 체외수정법(in vitro fertilization, IVF)과 추출된 난자로부터 기존의 핵을 제거하고 체세포 핵을 이식시키는 체세포핵이식기술(nuclear transfer, NT), 그리고 본 실험에 이용된 기술로서 성숙된 난자에 전기적 충격을 가하여 부화시키는 방법인 단위생식법(parthenogenesis)이 있다 [13, 14, 30]. 그러나, 체세포핵이식(NT)시 발생할 수 있는 비탈핵 현상에 의한 세포변형의 문제점이나 체외수정에 의한 유전적 변이성 (genetic variation)의 가능성들과 비교해 보았을 때, 순수한 난자의 단위생식을 통한 배아줄기세포의 생성은 나아가 환자맞춤형 줄기세포의 생성이 가능하다는 장점이 있다 [16]. 돼지배아줄기세포를 작성하기 위해서, 단위생식을 통해 난자를 활성화하여 배반포 생산한 후, 배반포의 내세포괴(inner cell mass, ICM)만을 추출하여 마우스배아영양세포(murine embryonic fibroblast, MEF)로 이루어진 지지세포(feeder cell)위에 안착시키는 작업을 시작하였다(SNU-200908-13). 배아줄기세포가 체외에서 줄기세포성(stemness)을 유지하며 자라기 위해서는 줄기세포성(stemness)에 관련한 물질의 발현을 조절하는 성장인자(growth factor)나 사이토카인(cytokine), 혹은 세포간 신호활성(cell to cell contact)이 필요하다 [5, 8, 11]. 이러한 효과를 얻기 위해 사용되는 지지세포는 13.5일령의 마우스태아로부터 배아영양세포(MEF)를 분리하여 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; 10% FBS, 1% antibiotics)에서 배양한 후, 다시 Streptomyces griseus로부터 분리한 강력한 항생제인 Mitomycin C (Sigma)를 37℃, 5% CO2  배양기에서 3시간 처리함으로써 세포증식억제(G2-arrest)를 유도하였다(Fig. 1. B) [15]. 한편, 단위생식을 통해 활성화된 배반포(Fig. 1. A)는 발달이 지속됨에 따라 자연적인 부화(hatching)를 통해 내세포괴(ICM)가 분리되어 나오고, 이렇게 분리된 내세포괴(ICM)를 마우스배아영양세포층(MEF layer)위에서 증식시켰다. 내세포괴 (ICM) 배양 3일 경과 후, 증식된 미성숙세포들을 관찰할 수있고(Fig. 1. C), 그로부터 4~6일 경과 후 미성숙세포들로 이루어진 콜로니(colony)가 형성되면, 이를 작은 조각으로 나누어 새로 준비된 지지세포(MEF)위에 안착시켜 2차 배양에 들어간다. 미성숙세포의 조각(cell clump)은 이식 후, 3~5 일이 경과되면, 한 층의 둥근 모양의 콜로니(colony)로 관찰되는 데(Fig. 1. D), micro-tip을 사용하여 콜로니(colony)를 선별한 후, 인슐린주사기 바늘을 사용하여 콜로니를 작은 조각으로 나눈다. 이 조각들은 새롭게 준비된 지지세포위로 다시 이식되어진 후, 4~5일을 배양하게 됨으로써 유지 및 배양된다.

Fig. 1. (A) Establishment of ESC-like cell lines. An activated porcine blstocyst (×100). Inner cell mass (ICM) were observed in parthenogentic activated oocyte (white arrow). (B) Murine embryonic fibroblast (MEF) (×40). Mitomycin C (MMC) treated MEFs were used as feeder cells for pESC-like cells. (C) An attached blastocyst at the beginning of outgrowth period and colony formation of the attached cells on day 3 (×100). (D) Morphology of pESC-like cell colonies (×40). ESClike cells having typical ESC morphology was detected, which was subpassaged beyond the 15st passage.

기존에 발표된 논문에 의하면, 돼지배아줄기세포의 전형성능(pluripotency)을 유지시키기 위하여 마우스와 인간 배아줄기세포의 체외배양에 필수적인 요소로 잘 알려진 LIF (leukemia inhibitory factor), bFGF (basic fibroblast growth factor) 그리고 초기 돼지 배반포의 지지세포 부착률에 효과적인 영향을 주는 것으로 알려진 SCF (stem cell factor)를 첨가한 배양배지를 사용하였다 [1, 10, 15, 17, 18, 19, 21]. 우리가 사용한 돼지배아줄기세포 배양배지의 성분은 lowglucose DMEM (Gibco):Ham’s F-10 (Gibco) (1:1)을 기본 배지로, 1% (v/v) penicillin-streptomycin (Gibco), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Gibco), 1 mM non-essential aminoacid (NEAA) (Gibco), 20 ng/㎖ recombinant human basic fibroblast growth factor (rhbFGF) (Gibco), 20 ng/㎖ recombinant human stem cell factor (rhSCF) (R&D systems), 20 ng/㎖ recombinant human leukemia inhibitory factor (rhLIF) (Sigma) 그리고 15% (v/v) ESC qualified FBS (Hyclone)를 첨가하여 사용하였다. 줄기세포의 줄기세포성(stemness)을 확인하는 방법은 아직도 개발 중이지만, 몇 가지 형식화된 실험법이 있다 [5, 12]. 그 중 하나로 배아줄기세포의 세포막에 존재하는 인산효소의 발현 여부를 검증해 보는 것이 있다 [7, 27]. 인산효소(alkaline phosphatase, AP)의 발현 여부를 확인하기 위하여 BCIP/NBT alkaline phosphatase(ALP) substrate detection kit IV (Vector Laboratory)를 사용하였다. 그 결과, Fig. 2. A와 같이 지지세포를 제외한 돼지배아줄기세포에만 특이적으로 발현되어 있는 결과를 확인할 수 있었다. 

Fig. 2. Characterization of pESC-like cell colonies derived from the culture of parthenogenetic blastocysts. (A) Alkaline phosphatase (AP) activity showing as blue color expression. The feeder cells were negative for AP activity. (B) mRNA expression of totipotency markers, Oct-3/4, Sox-2 and Nanog. GAPDH and mouse embryonic fibroblast (MEF) were used as a loading and negative controls for RT-PCR respectively (#L1,pESC Line 1;#L2,pESC Line 2). (C) Immunofluorescence for Oct- 3/4, Nanog and SSEA-4 in pESC-like cells. (D) Karyotyping of pESCs. Through Giemsa staining for chromosome analysis, the normal 38 porcine chromosome existed in pESC-l ike cell.

다음으로는 줄기세포의 자기재생(self-renewal) 능력에 결정적인 영향을 미치는 것으로 알려진 전사인자 Oct-3/4, Sox2, Nanog의 발현 여부를 확인하기 위하여 본 실험실에서 획득한 돼지배아줄기세포 유사세포주 2라인에 대하여 2 step-RTPCR을 수행한 결과, 마우스태아영양세포(MEF)에서는 발현되지 않고 돼지배아줄기세포주에서는 모두 발현 유도됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2. B). 또한 발현된 전사인자의 활성 여부와 관련하여, 이들 단백이 모두 핵(nucleus) 내에 존재하는지 알아보기 위하여 면역 형광 염색법(immunofluorescence, IF)을 통해 Oct- 3/4, Nanog의 세포 내 발현 위치를 확인해 보았다. 그 결과, 발현된 단백질이 거의 대부분 핵 (nucleus) 내에 존재하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 2. C). 세포표면단백질의 일종인 SSEA4의 발현도 추가로 확인하였고(Fig. 2. C), 전통적인 핵형분석실험방법에 따른 giemsa staining을 시행하여 38개의 정상적인 염색체수를 유지하고 있음을 확인하였다(Fig. 2. D). 다음으로, 돼지배아줄기세포 유사세포(porcine embryonic stem cell(pESC)-like cells)의 전형성능(pluripotency)을 검증해 보기 위하여, rh-bFGF, rh- SCF, rh-LIF를 제외하고, 혈청(fetal bovine serum, FBS)의 함유량을 10%로 줄인 조건으로 분화용 배지(differentiation media)를 구성하여 돼지배아줄기세포의 삼배엽성(three germ layer) 분화능을 실험해 보았다. 삼배엽분화를 유도하기 위한 배상체(embryoid body, EB) 형성은 지지세포로부터 분리해 낸 돼지배아줄기세포를 37℃, 20 % O2, 5 % CO2  조건에서 5분간 accutase (Gibco)를 사용하여 단일세포로 분리하는 것에서부터 시작된다. 각각의 단일세포는 40 ul의 분화용 배지에 3,000개의 세포가 분주되도록 희석하여 35 ㎜ 세포배양 용기(petridish) 안쪽 뚜껑에 약 10개의 방울로 분주하고 조심스럽게 세포배양용기 위로 뚜껑을 덮어 37 ℃, 20 % O2, 5 % CO2 조건에서 2일간 배양시켰다. 2일 경과 후, 단일세포였던 배아줄기세포는 40 ul 분화용 배양배지 안에서 배상체(EB)를 형성하였다(Fig. 3. A). 형성된 배상체(EB)의 일부는 조직배양용 용기(Tissue culture dish)로 옮겨져 분화배지 안에서 6일간 배양한 후, 각각 삼배엽을 대표하는 표지인자의 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, 외배엽(ectoderm) 인자인 NF-H (neurofilament-H)와 vimentin, 중배엽(mesoderm) 인자인 BMP4 (bone morphogenetic protein 4)와 desmin, 그리고내배엽(endoderm) 인자인α-amylase와cytokeratin-17의 mRNA 및 단백질이 모두 발현되었음을 확인하였다(Fig. 3. C, D). 

Fig. 3. Differentiation of pESC-like cell colonies derived from parthenogenetic blastocysts. (A) Formation of embryoid body(EB). At four days after induction, morphology of EB was detected by phase contrast microscope (×40). (B) Neuron-like morphology was found (×40). (C, D) mRNA and protein expression of three germ layer markers. mRNA expression of NFH (Neurofilament-H; ectoderm), BMP-4 (Bone morphogenetic protein-4; mesoderm) and a-amylase (indicated endoderm) by 2-step RT-PCR. Water was used as a negative control. Protein expression of Vimentin (endodermal-specific), Desmin (mesodermal- specific) and Cytokeratin17 (ectodermal-specific) by immunofluorescence assay (DC, Differentiated cells; NC, Negative control). (E) Expression of neuronal cell marker, NF-160 (Neurofilament- 160; neuronal precursor) and MAP2 (Microtubuleassociated protein-2; matured neuron).

또한 위와 같이 획득한 돼지배아줄기세포를 이용한 동물질병의 예방 및 치료, 이종장기 이식분야에 대한 임상적용의 가능성을 더 깊이 타진해 보고자, 특정 조직을 이루는 성체세포로의 분화를 유도해 보았다. 형성된 배상체(EB)에 대하여 10 uM retinoic acid (RA) (Sigma)를 4일간 처리하여 외배엽성 세포로의 분화를 유도한 다음, 다시 7~14일간 신경세포분화용 배지(N2 media)로 배양하면서 줄기세포의 신경세포분화를 유도하였다. 그 결과, RA와 N2에 의해 신경세포분화가 유도되어졌음을 확인하였다(Fig. 3. B). 신경전구 세포의 표지물질로 알려진 NF-160 (Neurofilament-160)의 발현과 성체 신경세포의 표지인자인 MAP2 (Microtubuleassociated protein-2)가 돼지배아줄기세포로부터 유도된 신경전구세포에서 더 특화된 세포로 분화가 가능해짐을 확인하였다(Fig. 3. E).

본 결과는 Talbot NC [25], Vassiliev [27], Wolf XA [28]등이 사용한 핵치환, 체내 또는 체외수정 기법으로 활성화된 배반포로부터 유도된 배아줄기세포가 아닌 단위생식 기법을 통해 활성화된 돼지배반포로부터 배아줄기세포를 확립하였다는 점에서 그 차이와 이용 가치가 있다. 첫째 핵융합에 따른 유전적 다형성 문제가 발생될 수 있는 가능성을 배제하고, 둘째 난자 공여자에 대한 맞춤형 줄기세포 치료제 적용성을 높여줄 수 있는 장점이 있다 [17, 25]. 또한 본 연구에 사용된 배지성분은 줄기세포의 전형성능을 유지하면서 최대 52회까지 연속계대배양이 가능하다는 점에서 줄기세포의 지속적이고 안정적인 체외 배양 조건을 제공하고 있다. 

확립된배아줄기세포는수의학분야에서실로 다양한부분에 적용될 수 있는데 [4, 15, 24], 특히 현대에 이르러 그 심각성이 대두되고 있는 인수공통전염병의 하나인 광우병(Prion disease) 치료제 개발 분야이다. 최근 광우병 모델마우스의 손상된 뇌에 줄기세포(fetal neural stem cells)를 주입하면 마우스의 생존률이 향상되었다는 결과 [22, 23]들은 줄기세포를 이용한 세포치료제의 가능성을 나타내는 결과라 할 수 있다. 현재까지 돼지 질병 치료를 위해 줄기세포가 적용된 경우는 없지만, 광우병의 예와 같이 난치병 치료를 위한 약물 개발에 희망적인 세포치료제로서의 가능성을 고려 해 볼 수 있다 [22]. 또한 돼지의 신경세포를 인간 뇌졸중 환자의 손상된 뇌에 이식하였을 경우, 일상생활이 가능해질 만큼 증상이 호전되었다는 선행 연구결과를 근거로 [20] 이종세포치료제로서의 유용한 생체자원이 될 수 있는 가능성을 제시해주고 있다. 

감사의 글

이 연구는 농림수산검역검사본부 수의과학기술개발연구사업(C-AD20-2010-13-01)에 의하여 수행되었다. 

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