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ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.36 No.1 pp.24-28
DOI :

Survey of neutralizing antibodies against porcine epidemic diarrhea virus from pig farms in Korea (2008∼2010)

Hyun-Soo Kim1,†, Yeon-Joo Kim1, Sang-Hoon Park2, Sang-Heui Seo1
1College of Veterinary Medicine, Chungnam National University
2Seoul Metropolitan Government Research Institute of Public Healthe and Environment
Received 15 February, 2012, Revised 6 March, 2012, Accepted 9 March, 2012

Abstract

During 2008~2010, 943 swine sera were collected from 45 farms located nationwide. Antibodies against porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) were tested via serum neutralization antibody test (SNT) using PEDV-SN, which was adapted and propagated on the Vero cell monolayer with trypsin-free culture media supplemented with more than 10% fetal bovine serum (FBS). All 45 farms were shown to have at least one or more seropositive pig. Of the 943 swine sera that were tested, 931 sera were neutralizing antibody positive against PEDV. These high seroprevalence rates seemed to be due to vaccination or natural infection of PEDV. In a plaque reduction neutralization test (PRNT) using a swine serum showing SN titer of 1:32, a greater than 50% plaque reduction was observed in up to 160 times serum dilution.

04 12-02 김현수.pdf415.5KB

서 론

 돼지의 유행성 설사는 1971년 영국에서 처음 관찰된 이래 현재까지 양돈산업에 많은 피해를 주고 있다 [20, 21]. 돼지유행성 설사의 원인체는 porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)이며, 자돈뿐만 아니라 비육돈에서도 임상증상이 관찰되는 것으로 알려져 있다 [17]. PEDV에 감염된 자돈의 주된 임상증상은 수양성 하리이다. 1주령 이하의 자돈은 탈수에 의한 폐사율이 높으며, 일반적으로 치사율은 50%에서 100% 까지 치사율을 보이는 경우도 있다. 그러나 신생자돈에서의 모체 이행항체 수준에 따라 임상증상의 정도,치사율 및 질병지속 기간 등에 차이가 있다. PED는 전염성위장염 (transmissible gastroentiritis: TGE)와 임상증상이 유사하지만, PEDV에 감염된 말기 육성돈에서는 TGE virus보다 더 심한 증상이 관찰되는 점에서 감별이 가능하며, 또한 PEDV는 열에 비교적 강하여 TGE virus와 달리 계절에 관계없이 연중 발생되고 있는 것이 특징이다 [26].

 세포배양에서 증식된 PEDV는 50℃에서 30분간 가열할 경우에도 감염력이 유지되는 반면, 60℃에서 30분 동안 가열할 경우 감염력이 완전히 상실되었으며, 4℃에서는 pH5.0와 pH 9 사이에서 안전한 반면에 37℃에서는 pH 6.0 와 pH 8.0 사이에서만 감염력이 유지되는 것으로 알려져 있다[4, 9, 18]. PEDV 증식은 TGE virus, rotavirus, bovine coronavirus, astrovirus와 같은 다른 장내 병원성 바이러스들과 같이 trypsin 의존성이 매우 높은 것으로 보고되었다 [5, 8, 25, 27]. 또한 세포배양액에 포함된 소 태아혈청에 의하여 trypsin의 작용이 억제되거나, 세포막 수용체 (cell membrane receptor)에 대한 바이러스 흡착이 방해됨으로써 결과적으로 바이러스의 증식이 억제되는 것으로 알려져 있다 [6, 9, 10].

 많은 세포 주들 가운데 Vero cell [9]과 돼지 방광 및 신장세포 [24], 돼지 유래의 KSEK6 및 IB-RS2 [14] 세포에서 PEDV가 증식되는 것으로 알려져 있으나, 세포배양법을 이용하여 감염돼지의 가검물로 부터 PEDV를 분리하고, 배양하는 것은 매우 어려운 것으로 알려져 있다 [26].

 PEDV와 같은 바이러스에 대한 중화항체가를 측정하는 방법으로 serum neutralization antibody test (SNT)와 plaque reduction neutralization test (PRNT)가 많이 이용되고 있으며, 이들 가운데 PRNT는 바이러스 중화항체가를 측정하는데 가장 널리 인정되는 방법으로 알려져 있으며, 바이러스감염으로부터 동물에 대한 방어력은 바이러스 중화항체의 수준과 높은 상관관계가 있음을 보고하였다 [2, 3, 7, 11, 12, 16, 22, 28]. 또한 바이러스에 대한 중화항체 검사는 바이러스 감염에 대한 진단뿐만 아니라 감염개체나 집단의 면역상태 또는 항체 보유율을 측정하는데 이용되어 왔다 [1, 13, 15, 19].

 본 연구에서는 혈청이나 trypsin에 영향을 받지 않고 증식이 잘 되는 중화항체 검출용 PEDV를 배양하고, 이를 이용하여 돼지 농장으로부터 수집된 돼지혈청의 PEDV에 대한 중화항체 보유율을 조사하였으며, 또한 PRNT를 통하여 혈중에 존재하는 중화항체가 PEDV에 대하여 특이성이 있음을 확인하여 그 결과를 보고하였다.

재료 및 방법

1. 세포

 PEDV의 증식에 필요한 Vero cell을 Minimum Essential Medium (MEM, Thermo Scientific, USA)에 10% 소 태아혈청 (GIBCO, USA)과 항생제가 함유된 배지에 배양하였다.

2. 바이러스

1) PEDV 배양

 농림수산검역검사본부에서 분양받은 PEDV SM-98 strain [14]을 25㎠ cell culture flask에 배양된 Vero cell monolayer에 증식하였다. Flask의 배양액을 제거한 후 37℃로 미리 가열된 PBS로 2회 헹구어낸 다음 PEDV를 0.1 multiplicity of infection (MOI)로 접종한 다음 37℃에서 약 1시간동안 감작시킨 후 접종 액을 제거하고, 소 태아혈청을 함유하지 않고 trypsin (10㎍/㎖)만을 함유하는 MEM 3㎖를 첨가하여 37℃, 5% CO2  세포배양기에서 배양하였다. 세포변성효과 (cytopathic effects, CPE)가 전체 cell monolayer의 70% 정도 나타났을 때 cell culture flask를 열렸다 녹였다를 2회 반복한 다음 바이러스 배양액을 수확하여 1,500rpm에 15분간 원심하고, 바이러스 함량을 측정한 후 상층액을 0.5㎖씩 소분하고 -70℃에 냉동상태로 보관하면서 혈청 중화시험용 바이러스 배양에 사용하였다. 바이러스 함량의 측정은 바이러스 배양액을 trypsin (10㎍/㎖l)을 함유하는 MEM으로 10배 계단 희석하여 Vero cell monolayer가 조성된96-well plate에 희석단계별로 10개의 well에 각각 100㎕씩 접종한 후 37℃, 5% CO2  세포배양기에서 6일간 배양하였다. 배양된 cell monolayer에서 CPE를 현미경으로 판독하였으며, Reed & Muench 법으로 바이러스 함량을 계산하였다. 측정된 PEDV SM-98 바이러스의 함량은 1×106.5  TCID50 /㎖이었다.

2) 혈청 중화시험용 PEDV 배양

 혈청중화항체 시험용 PEDV를 배양하기 위하여 우선 24-well cell culture plate에 배양된 Vero cell monolayer에 200㎕의 PEDV 배양액 (0.1MOI)을 접종한 다음 37℃에서 약 1시간동안 감작시킨 후 접종액을 제거하고, 소 태아 혈청을 함유하지 않고 trypsin (10㎍/ml)만을 함유하는 MEM 1㎖를 첨가하여 37℃, 5% CO2  세포배양기에 배양하였다. 이와 같은 방법으로 MEM에 함유된 trypsin의 농도를 단계적으로 줄여가면서 연속적으로 계대 배양하였다. Trypsin을 전혀함유하지 않은 MEM에서 잘 증식되는 PEDV를 배양한 후 다시 소태아 혈청 0.01%를 함유하는 MEM으로 배양을 시작하여 점차로 혈청 농도를 증가시켜 최종적으로 10% 이상의 혈청농도에서도 증식이 가능한 PEDV를 배양하였으며, 이를 PEDV-SN이라고 명명하였다. PEDV-SN의 역가는 1×105.5  TCID50 /0.1㎖였다. 바이러스 함량을 측정하는 방법은 위에 기술한 것과 동일한 방법을 사용하였으나, 바이러스 희석에 사용된 MEM에는 trypsin을 첨가하지 않았다.

3. 검사시료

 전국의 농장으로부터 수집하여 PEDV 대한 항체검사를 목적으로 의뢰된 943개의 돼지혈청을 사용하였다. 의뢰된 돼지혈청을 12,000rpm으로 10분간 다시 원심하여 상층액을 채취하여 -20℃에 보관하면서 중화항체가 시험에 사용하였다. 항체 중화시험을 위해서 항체검사 전 시료를 56℃에서 30분 동안 비동화 하였다.

4. 중화항체 시험

 96-well plate의 각각의 well에 MEM 50㎕를 주입하고, plate의 첫 well에는 검사혈청 50㎕ 주입한 후 micropipette 를 이용하여 이진법으로 희석한 후 PEDV-SN 희석액 50㎕(1×100TCID50 /0.1㎖) 씩 각각의 well에 넣고, 약 10초간 진탕한 후 37℃, 5% CO2 를 함유하는 세포배양기에서 1시간동안 반응을 시킨 다음 바이러스 혈청 혼합물을 Vero cell monolayer가 배양된 96-well plate의 상응하는 위치에 있는 well로 옮겨 37℃, 5% CO2 를 함유하는 세포배양기에서 6일간 배양 후 광학현미경으로 관찰하여 CPE가 관찰된 세포는 PEDV가 증식된 것으로 판정하였으며, 중화항체가는 바이러스 증식을 완전하게 억제하는 혈청의 최고 희석배수의 역수로 표시하였다.

5. Plaque reduction neutralization test (PRNT)

 돼지 혈청에서 검출된 중화항체와 PEDV 사이의 특이성(virus-antibody specificity)을 조사하기 위해서 혈청중화항체 역가가 1:32인 돼지 혈청을 이용하여 PRNT를 실시하였다.

 Tissue culture petri dish (30mm×15mm) 당 약 50∼60개 (200㎕)의 plaque가 관찰되도록 예비시험을 통하여 PEDVSN 희석액을 준비하였다. 56℃ 항온 수욕조에서 30분간 비동화된 돼지 혈청을 MEM으로 5배 희석하고, 이를 다시 이진법으로 희석하였다. 계단 희석된 각각의 혈청 400㎕와 동량의 PEDV-SN 희석액을 혼합하여 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후 MEM 1.2㎖를 가하여 잘 섞은 후 tissue culture petri dish (30㎜×15㎜)에 조성된 Vero cell monolayer에 각 dish 당 1㎖씩 2개의 petri dish에 접종하였다. 접종물이 cell monolayer 표면에 골고루 퍼지게 한 후 1시간 동안 5% CO2 를 함유하는 37℃ 세포배양기에서 감작시킨 다음 접종액을제거하고MEM으로1회행군다음40℃의agar overlayer media (1.6% agar + 동량의 2X MEM)를 혈청 희석 단계별로 준비된 2개의 peri dish에 2㎖씩 가하여 실온에서 agar가 완전히 굳을 때까지 방치한 다음 5% CO2 가 포함된 37℃ 세포 배양기에서 3일간 배양 후 neutral red를 함유하는 agar overlayer media 2㎖를 각각의 perti dish에 첨가하여 완전히 굳도록 20분간 방치 후 5% CO2 가 포함된 37℃ 세포 배양기에서 배양하면서 투명색의 plaque를 관찰하였다. 대조petri dish의 plaque 숫자와 비교하여 plaque 감소율을 산출하였다.

결과 및 고찰

 2008년부터 2010년 까지 PEDV 항체가의 측정을 목적으로 강원과 제주지방을 제외한 전국 45개 농장으로부터 943개의 돼지혈청이 의뢰되었다. 의뢰된 혈청을 돼지 생산단계(production phase) 별로 분포를 분석한 결과, 포유자돈 (suckling pig; 생후 20일령까지), 이유 전기 자돈 (cold nursery pig; 21~35일령), 이유 후기 자돈 (hot nursery pig; 36~70령), 육성돈 (growing pig; 71~112일령), 비육돈 (finishing pig; 113일령 이상) 및 번식돈 (후보돈, 모돈, 웅돈)의 혈청가검물이 각각 81개, 102개, 205개, 274개, 121개 및 160개였다.

 PEDV 항체를 측정한 결과, 45개 농장 모두에서 PEDV항체가검출되었다. 개체별로는943개의혈청가운데931 (98.7%)개의혈청에서PEDV 항체가 검출되었다. 항체가 별분포를 보면 1:64가 167두 (17.7%)로 가장 많고, 그 다음으로 1:128이163두 (17.3%), 1:32가159두(16.9%), 1:16이140두 (14.8%),1:256이81두(8.6%), 1:8이67두(7.1%), 1:512가51두 (5.4%),1:4가 40두 (4.2%), 1:1024가 27두 (2.9%), 1:2 이하가 12두 (1.3%) 순이었다 (Table 1).

 검사혈청의 숫자가 비록 제한적이지만 농장의 분포가 강원과 제주를 제외하고 전국적으로 분포하고 있는 만큼, 국내에 있는 대다수 다른 농장에서도 위와 비슷한 높은 항체 보유율을 보일 것으로 생각된다. 혈청중화항체 시험 방법으로는 자연감염과 백신에 의한 항체의 감별이 불가능하지만, 이와 같이 높은 항체 보유율은 국내 양돈장에서 PEDV 백신의 광범위한 접종에 기인된 것으로 여겨진다.

 1950년대에 처음 기술된 이후 Russel 등 [23]에 의하여 개량된 PRNT는 세포배양 petri dish 내에서 virus-antibody간의 상호작용을 통하여 바이러스 감염력 (infectivity)에 대한 항체의 효과를 측정하기 위해서 고안되었다.

 또한 PRNT는 많은 바이러스 항체검사법 가운데 혈청학으로 virus-specific antibody를 측정할 수 있는 가장 우수한검사법이며, PRNT에서 얻어진 항체 역가와 바이러스 감염에 대한 방어력 사이에는 높은 상관성이 있는 것으로 알려져 있다.

 본 연구에서는 혈청중화항체 시험법으로 측정된 중화항체가가 PEDV-specific antibody 인지 여부와 항체의 바이러스 증식 억제 효과를 측정하기 위해서 중화항체가가 1:32인 돼지 혈청을 이용하여 PRNT를 실시한 결과 160배 까지 희석하여도 63.4% 의 plaque 감소 효과가 나타났으며 혈청희석배수의 증감에 따라 plaque 수의 증감, 즉 PEDV 감염력의 증감이 관찰되었다 (Table 2). 이러한 결과는 혈중중화항체가 PEDV에 특이성이 있는 항체 (PEDV-specific neutralizing antibody) 임을 증명하고 있으며, 또한 비교적 낮은 혈청중화항체가 일지라도 PEDV 침입 시 바이러스의 체내 증식을 억제함으로써 질병의 증상이나 경과에 어느 정도 영향을 미칠 것으로 생각된다.

Table 1. Seroprevalence of PEDV antibody and distribution of SN antibody titers

Table 2. Plaque reduction neutralization test using a swine serum showing SN titer of 1:32

감사의 글

 이 논문은 2008년도 충남대학교 학술연구비의 지원에 의하여 수행되었습니다.

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