Journal Search Engine
Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citaion korean bibliography PMC previewer
ISSN : 2287-7991(Print)
ISSN : 2287-8009(Online)
Journal of the Preventive Veterinary Medicine Vol.36 No.1 pp.29-35
DOI :

High titer production of canine distemper virus using cloned MDCK cell lines

Kyu-Kye Hwang, Kyong-Leek Jeon, Soon-Beom Cho
College of Veterinary Medicine, Jeju National University
Received 24 February, 2012, Revised 22 March, 2012, Accepted 29 March, 2012

Abstract

Canine distemper virus (CDV) causes serious and often fatal disease in dogs. Currently, various cells or cell lines have been used to detect or produce CDV. In order to set up the conditions, we separated two different cell lines from Madin-Darby canine kidney (MDCK) and named as MDCK-F (fibroblast-like) and MDCK-E (epithelial-like) by Na2EDDA treatment. CDV seed virus was prepared using MDCK cells and inoculated into MDCK-F and MDCK-E including MDCK with various ranges of multiplicity of infection (MOI) to confirm the optimal amount of virus inoculation. The virus titer of TCID50/ml was calculated by inoculation of serially diluted virus into 96-well plate of MDCK cells. The titer and cytopathic effect (CPE) in MDCK-E were compared to those in MDCK-F. The titer of seed CDV was 1.24×106 TCID50/ml. Optimal MOI was about 0.1 for both MDCK-F and MDCK-E to obtain highest titers of 108 TCID50/ml and 5 × 108 TCID50/ml respectively. CPE in MDCK-E was shown 4 days after inoculation whether in MNCK-F 5~6 days after inoculation. We can obtain highest titer of 5 × 108 TCID50/ml with 0.1 MOI using MDCK-E. MDCK-E was more susceptible for CDV production than MDCK-F.

05 12-06 황규계.pdf819.1KB

서 론

 Canine Distemper Virus(CDV)는 Paramyxoviridae에 속하는 Morbillivirus로서 야생 및 가축 포유류에 Canine Distemper(CD)를 유발하는 원인체로 알려져 있다 [1, 11]. CD는 전 세계적으로 발병하는데, 날씨가 추워지면 주로 발생하며 모체 이행 항체가 소실되는 6~8주령의 자견에서 감수성이 가장 높다. 발열, 코감기, 뇌수막염, 결막염, 위장관염, 폐렴 등의 증상을 수반하며, 심한 경우 신경증상과 함께 폐사에 이르는 심각한 질병이다. 이러한 개 디스템퍼의 예방을 위해 오랜 기간 동안 약독화 백신을 사용하여 디스템퍼의 발생 정도를 감소시켜 왔다 [6]. 현재 사용되고 있는 약독화백신은 ferret, chicken embryo, Vero cell 등을 이용한 계대배양 과정을 통해 생산되고 있으며, 바이러스 생산 수율을 높이고 약독화 과정을 보다 더 효율적으로 할 수 있는 대상에 대한 연구가 활발히 진행중이다 [2, 7, 8]. Madin-Darby canine kidney(MDCK) 세포는 개 신장 유래의 세포로서, 디스템퍼 바이러스에 대한 감수성이 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 MDCK 세포주의 낮은 바이러스 생산 수율 때문에 숙주세포로의 이용은 미미한 실정이다 [4, 9, 11]. MDCK세포주와 같은 기존에 제작되어 있는 세포주들은 주로 암세포화 된 세포들로 생리적으로 일반 세포와는 많은 차이점을 가지고 있어서 숙주세포 특이성이 강한 바이러스에 대한 감수성이 약한 편이다. 또한 MDCK 세포 배양 시 현미경 상으로 형태가 상이한 2가지 이상의 세포가 혼재해 있음을 확인할 수 있는데, 실제로 바이러스를 접종하면 이 세포들 간의 감수성이 다른 것을 확인할 수 있다 [4, 10]. 이에 본 연구에서는 MDCK 세포를 배양한 후 0.01% edetate disodium dihydrate(Na2 EDDA)를 사용하여 각이 진 세포(square shape)와 둥근 세포(round shape)로 분리함으로써 디스템퍼바이러스에 감수성이 높은 개 신장 유래 세포주를 작성하고, 최적의 multiplicity of infection(MOI) 설정을 통해 보다 효율적으로 디스템퍼 바이러스를 증식시킬 수 있는 방법을 모색하였다.

재료 및 방법

1. 세포주와 바이러스주

 실험에 사용된 MDCK 세포주(KCLB No. 10034)는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 바이러스는 중앙백신연구소에서 분양받은 CDV(3CL DEF4)를 사용하였다.

2. 바이러스 seed 제작

 CD seed virus를 얻기 위해서 MDCK 세포를 T75 세포배양용 flask에 12시간 배양하여 70∼80%의 세포단층이 형성되도록 하고 10% FBS(fetal bovine serum. USA. GIBCO )와 0.01% antibiotics(1×104  units/ml of penicillin, 1×104 units/㎖ of streptomycin)가 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified essential medium, USA. GIBCO ) 배지에 배양하였다. 계대배양 12시간 이후에 배지를 제거하고, 세포세척용 PBS 15㎖로 2회 세척한 후 PBS를 모두 버리고 분양받은 CDV 0.5㎖를 접종하였다. 바이러스 접종 후 2.5㎖의 0.01% antibiotics가 첨가된 DMEM 배지를 추가하여 36℃에서 배양하고, 4시간 경과 후 10% FBS와 0.01% antibiotics가 첨가된 DMEM 배지 12㎖를 추가하여 cytopathic effect(CPE)가 관찰될 때까지 배양하였다. 6일 후 CPE가 80% 이상 발생한 것을 확인하고 배지를 수거하여 50㎖ cornical tube에 넣고 160 ×g로 5분간 원심분리하여 상층액을 수거하였다. 수거한 상층액은 0.45㎛ cellulose acetate 필터를 사용하여 정제하고, 0.1㎖씩 micro vial에 분주한 후 액체질소탱크에 보관하고 실험용 CDV seed로 사용하였다. 냉동 48시간 이후 소분한 micro vial 하나를 녹여서 96-well 세포배양용 plate에 배양 중인 MDCK cell에 10진 희석하여 well당 20 ㎕씩 접종하였다. 접종 2시간 후 DMEM-A 배지(2% FBS함유)를 첨가하여 total volume을 100 ㎕/well이 되도록 보정한 후 7일 동안 배양하면서 CPE를 관찰하고, CPE를 형성하는 well의 희석 배수를 계산하여 TCID50/㎖를 구하였다.

3. MDCK 세포의 cloning

 T25 세포배양용 flask에 MDCK 세포를 약 1 대 3 비율로 계대배양하고, 계대배양 18시간 경과 후 배지를 제거하고 세포세척용 PBS를 5㎖ 첨가하여 세포를 세척한 후 0.01% Na2 EDDA용액을 1㎖ 첨가하였다. 2~4분 동안 현미경으로 각이 진 세포의 colony 경계가 박리되는지를 관찰하고 DMEMC 배지(10% FBS 함유)를 4㎖ 첨가하여 조심스럽게 플라스크를 흔들어 주었다. 세포가 박리되면 배지를 수거하여 50㎖ cornical tube에 옮겨 새로운 배지를 20㎖ 첨가하고 160 × g로 3분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 5㎖의 새로운 배지를 넣어 T25 세포배양용 flask에서 배양하고, 이를 MDCK- F로 명명 하였다. 1차로 약간 길쭉한 모양의 세포의 colony가 제거된 MDCK 세포는 세포세척용 PBS로 세척하고, DMEM- A 배지를 첨가하여 6시간 동안 36℃, CO2 incubator에서 배양한 후 PBS로 2번 세척하고 0.02% Na2 EDDA용액을 1㎖ 첨가하여 1∼3분 동안 현미경으로 세포가 박리되는 것을 관찰하면서 남아있던 길쭉한 모양의 세포 colony가 충분히 박리되면 DMEM 배지로 3회 세척하고, DMEM-C배지를 첨가하여 24시간 동안 36℃, CO2  incubator에서 배양하였다. 현미경으로 관찰하면서 길쭉한 모양의 세포가 관찰되지 않을 때까지 여러 번 반복한 후 MDCK-E로 명명하였다.

4. MOI 선정과 바이러스 titration

 6-well 세포배양용 plate에 MDCK 세포와 MDCK-F 그리고 MDCK-E세포를 20시간 동안 배양하여 약 40%, 70%, 100%의 세포단층이 형성되도록 하였다. 배양된 각각의 세포를 세포세척용 PBS로 2회 세척 후 CDV seed 바이러스 (1.34×106  TCID50 /㎖)를 DMEM 배지로 희석한 후 접종량을 달리하여 multiplicity of infection(MOI) 0.01, 0.1, 1 그리고 10 별로 접종하고, 4시간 동안 36℃, CO2  incubator에서 배양한 후 DMEM-C 배지를 첨가하고, CPE의 발생을 관찰하였다. 50%의 CPE가 발생하면 배지를 수거하여 160 × g로 3분간 원심분리하여 상층액을 모은 후 10진 희석하여 96-well 세포배양용 plate에서 자라고 있는 MDCK 세포에 접종하고, 바이러스 역가를 측정하였다.

5. CPE별 배지와 세포내의 virus titration

 MDCK 세포와 MDCK-F 그리고 MDCK-E 세포의 세포내와 배지 중의 바이러스 양을 알아보기 위해서 세포를 각각 3개의 T25 세포배양용 flask에 DMEM-C 배지로 70%의 세포단층이 형성되도록 24시간동안 배양한 후 CD seed virus(1.34×106  TCID50 /ml)를 MOI 0.1로 1㎖ 접종하고 4시간 후 배지를 4㎖씩 첨가하였다. 주기적으로 세포 상태를 관찰하면서 CPE가 발생하기 직전에 세포별로 하나씩의 T25 세포배양용 flask에서 5㎖의 배지를 수거한 후 T25 세포배양용 flask를 -80℃ 냉동고에서 급속히 냉동시키고 1분 후 36℃ 항온수조에서 해동시켜 세포를 파괴하는 과정을 3회 반복하고, 새로운 배지를 5㎖ 첨가하여 파괴된 세포와 함께 수거하였다. CPE가 50% 발생했을 때와 90% 발생하였을 때를 각각 나누어 상기의 과정을 반복하여 배지와 파괴된 샘플을 각각 수거하였다. 이렇게 수거된 9개의 배지 샘플과 9개의 파괴된 세포의 샘플을 각각 96-well 세포배양용 plate에서 자라고 있는 MDCK 세포에 10진 희석하여 접종을 한 후 virus titration을 하여서 CPE별 세포내와 배지에서의 바이러스의 수율을 비교하였다.

6. FBS 농도에 따른 바이러스 수율 측정

 CDV 숙주세포의최적배양조건을탐색하기위하여DMEM배지의 FBS 농도와 숙주세포가 이루는 단층의 비율별로 바이러스 수율을 비교하였다. MDCK 세포와 MDCK-F 그리고 MDCK-E세포를 24시간 동안 배양하여 약 40%, 70%,100%의 세포단층이 형성되도록 T25 세포배양용 flask에 계대배양하였다. 계대배양 후 20시간 경과된 후 세포단층의 비율을 확인하고, 세포세척용 PBS로 2회 세척한 후 CDV를 0.1 MOI로 희석하여 1㎖ 접종하였다. 바이러스 접종 4시간후에 FBS가 각각 2%, 5% 그리고 10% 함유된 DMEM 배지를 4㎖씩 추가하고, CPE가 90% 발생할 때까지 배양하였다. CPE가 90% 발생하면 배지를 수거하여 160×g로 3분간 원심분리하여 상층액을 모은 후 96-well 세포배양용 plate에서 자라고 있는 MDCK 세포에 10진 희석하여 접종한 후 바이러스 수율을 관찰하였다.

결 과

1. 바이러스 seed 제작과 MDCK 세포 Cloning

 CD seed virus를 제작하고 역가 측정을 한 결과, 1.24×106  TCID50 /㎖로 100 ㎕씩 분주된 150개의 vial을 얻을 수 있었다.

 MDCK 세포를 0.01% Na2 EDDA 용액을 이용하여 처리하였을 때 일부 세포가 세포주변부가 배양용기 표면에서 떨어지면서 둥글게 변하는 현상(rounding)을 나타내었고(Fig. 1), 이렇게 둥글게 변하는 세포의 주위에는 변화가 없이 용기 표면에 견고히 부착되는 세포가 존재하였다. Na2 EDDA 용액에 의하여 초기에 박리가 되어서 나왔던 세포를 분리하여 배양하고 MDCK-F라 명명하고, Na2 EDDA 용액에 대한 저항성을 가지고 있는 세포는 추출한 후 배양하여 MDCK-E라 명명하였다. MDCK-F와 MDCK-E의 성장 특성에 있어서 유의성 있는 차이는 발견하지 못하였지만 계대배양 시MDCK-E의 경우 세포의 주변부가 MDCK-F에 비하여 다소 각이 진 모양을 나타내었고, 세포 전체가 길쭉하지 않고 둥근 형태이고, 세포와 세포 사이의 경계선이 보다 명확한 특징을 지니고 있어 보다 전형적인 상피세포의 형태를 띠고 있었다(Fig. 2).

2. CDV 배양을 위한 최적의 MOI

 MDCK, MDCK-F 그리고 MDCK-E 세포를 MOI 0.01,0.1, 1 그리고 10으로 접종한 결과 MOI 0.1에서 가장 높은titer를 보였다. MDCK의 경우는 MOI 10으로 접종하였을때 초기 CPE의 발생은 있었으나, 50%까지 CPE가 진행되지 못하였다. MDCK-E의 경우, MOI별로 모두 CPE는 발생하였으나, MOI 10에서 초기에 CPE가 빠르게 발생하였다가 주변 세포로 번지지 못하고 사멸해 버렸다. MDCK-F는 전체적으로 가장 낮은 CDV 역가를 나타내었으며, 특히 MOI 0.01에서는 전혀 CPE가 관찰되지 않았다(Table 1).

Fig 1. Separation of MDCK-E (epithelial cell-like MDCK cells) from MDCK cell line by treating with Na2EDDA. A:Cultured cells before Na2EDDA treatment. B: MDCK-F (fibroblast cell-like MDCK cells) were rounded and detached from culture-flask by the first Na2EDDA treatment. Arrow indicates MDCK-F colony. Scale-bar: 60 um

Fig 2. Different cell line from MDCK by Na2EDDA treatment.A: MDCK-F (fibroblast-like), B: MDCK-E (epitheliallike). Scale-bar: 20 um

3. CPE별 배지와 세포내의 Virus의 수율

 CDV를 MDCK, MDCK-E 그리고 MDCK-F에 MOI 0.1로 접종을 하여 CPE가 발생하기 직전과 CPE 발생률이 50%, 90% 일 때 배지와 세포를 따로 수거하여 바이러스의 titer를 비교하였다. CPE가 발생하기 직전에 세포내와 배지의 바이러스 역가는 전반적으로 세포내에서 더 높은 결과를 나타내었으며, CPE 발생이 50%가 넘어가면 세포 내 보다는 배지에 월등히 많은 바이러스가 있다는 것을 확인하였다. CPE가 발생하기 직전에 수거한 배지에서 측정한 바이러스 역가는 MDCK의 경우가 가장 낮았으며, MDCK-E가 가장 높았다(Fig. 3). 반면, 세포내에 있던 바이러스 역가의 측정 결과는 MDCK-F가 가장 낮았고 MDCK-E가 가장 높았다(Fig.4). CPE 발생이 50%일 때와 90%일 때 수거한 배지와 세포내에서의 바이러스 역가는 모두 MDCK-E가 가장 높았다. 전체적으로 MDCK-E가 바이러스 수율에 좋은 결과를 보였다.

Fig 3. Titers of CVD in various culture supernatants. MDCK-E cell lines were 10~100 times more susceptible to produce CDV than MDCK cell line.

Table 1. Titration of canine distemper virus (CDV) produced from MDCK, MDCK-E (epithelial-like) and MDCK-F (fibroblast-like) cells with various multiplicity of infection (MOI)

Fig 4. Titration of canine distemper virus (CDV) associated in MDCK, MDCK-E and MDCK-F cells. After harvesting CDV-infected cells, the cell associated viruses were titrated using cell-lysate. The titers of cell associated viruses were increased until 50% of cells showed cytopathic effect (CPE) and then gradually decreased thereafter.

4. FBS 농도에 따른 바이러스 수율

 현재까지 실험으로 CDV 수율이 가장 높았던 MDCK-E를 계대 24시간 후 각각 40%, 70% 그리고 90%의 세포 단층이 형성되도록 계대하고, DMEM-A(2% FBS포함 배지), DMEM-B(5% FBS포함 배지) 그리고 DMEM-C(10% FBS포함 배지) 배지로 바이러스를 배양하였다. 세포 단층이 형성된 정도별로 바이러스 수율을 비교해 보았을 때 70% 정도의 세포단층이 형성된 상태에서 바이러스를 배양하는 것이 가장 높은 수율을 보였다. FBS 첨가량별로 비교해 보았을 때에는 DMEM-C 배지로 배양하는 것이 가장 높은 수율을 보인다는 것을 확인할 수 있었으나, 70% 정도의 세포단층이 형성된 상태에서는 DMEM-B 배지로 배양할 때와 비교하여 큰 차이가 없었다. 실험적으로 최적의 배양 조건은 70% 세포단층을 이루었을 때 10% FBS가 함유된 배양하는것이지만, CDV를 대량으로 배양하기 위해서는 70% 세포단층을 이루었을 때 5% FBS가 함유된 배지로 배양하는 것이 유리하다는 것을 알 수 있었다(Fig. 5).

고 찰

Fig 5. Effects of cell population and fetal bovine serum (FBS) content in culture media on the titers of canine distemper virus (CDV). Different populations of MDCK-E cells (40%, 70% and 100% mono-layered) and content of FBS (2%, 5% and 10%) in media were used for CDV propagation. The virus titer in culture supernatant reached at the highest point when 70% mono-layered MDCK-E cells were used with 10% FBS containing media.

 본 연구에 사용되어진 CDV는 chicken embryo에 순화된 virus주로서 현재 백신생산에 사용되고 있다. 과거부터 CDV를 증식시키기 위하여 embryo chicken eggs(ECE)가 사용되어 왔는데, 이 방법은 계대하기까지 시간이 많이 걸리고 소요비용이 많이 든다는 단점이 있다 [2~4]. 반면, CDV에 감수성이 있다고 알려진 Vero cell과 MDCK cell은 CD에 대한 감수성이 있어서 바이러스 분리에는 사용을 하지만, 대량 배양을 위한 숙주세포로는 사용을 하지 않고 있다 [8, 10, 13]. 특히 일반적으로 MDCK 세포는 개 신장 유래 세포주로서 CD에 대한 감수성과 수율이 다른 세포주에 비하여 높을 것 같으나, 실제로 감수성 테스트를 하면 결과가 낮은 것을 볼 수 있다. MDCK 세포를 이용한 CDV 감수성에 대한 다른 연구를 보면 같은 MDCK 세포 내에서도 CDV에 대한 감수성이 다른 세포들이 혼재해 있음을 알 수 있다 [9, 11, 12]. 이처럼 MDCK 세포주가 감수성과 수율이 낮은 이유는 감수성이 다른 여러 가지 세포가 섞여 있기 때문이라고 생각되어진다. 실제로 MDCK 세포를 배양하면 모양이 다른 2가지의 세포가 관찰되는데 형태학적으로 세포질의 모양이 길쭉한 fibroblast-like cell이 30~40% 정도 발견된다. MDCK 세포주를 배양한 후 Na2 EDDA와 농도가 낮은 FBS를 함유한 배지를 이용하여 시간별로 처리하면서 농도가 낮은 배지를 첨가하여 세포를 배양하여 MDCK-E와 MDCK-F을 효율적으로 분리할 수 있었다 [5]. 이 발표한 논문에 따르면 Na2 EDDA는 세포간의 Ca2+ 결합 사이에 들어가서 섬유아세포의 결합을 효과적으로 저해할 수 있다고 하였다. 배양 시에 세포가 서로 결합하는 많은 형식 중의 하나인 anchorage 결합에 의한 세포 간 결합은 매우 강한데, 이 결합은 상피세포가 섬유아세포보다 더욱 더 풍부하게 가지고 있다 [14]. 이로 인해 Na2 EDDA를 처리할 경우, 상피세포가 섬유아세포보다 더욱더 오랜 시간 배양 용기에 붙어 있을 수 있게 한다. MDCK-E는 MDCK-F과 비교하여 형태학적으로 전형적인 상피세포의 모양을 가지고 있으며 MDCKF은 MDCK-E에 비하여 fibroblast-like한 형태를 가지고 있었다(Fig. 2). Na2 EDDA를 처리한 결과, fibroblast- like한 형태를 가지고 있는 MDCK-F이 먼저 분리가 되어서 나왔으며, MDCK-E는 Na2 EDDA에 처리에 대하여 보다 높은 저항력을 가지고 있었다.

 Na2 EDDA를 이용하여 분리하고 CDV에 대한 감수성을 검사한 결과, MDCK-E가 감수성이 높은 것으로 나타났다(Fig. 3). 이는 일반적으로 상피세포가 섬유아세포에 비하여 바이러스에 대한 감수성이 더 높은 사실과 일치했다. 세포주로 확립된 세포라 하여도 배양하는 환경이 변하거나, 배양 계대수가 증가하면 세포의 특성이 조금씩 변하게 된다. MDCK 세포주는 확립된지 오래된 세포주로 계대배양이 된지 오랜 시간이 흐름에 따라서 현미경적 관찰시 형태학적으로 세포모양이 서로 다른 세포들이 혼합되어 자라고 있는 모습을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 이처럼 고정이 된 세포주라고 하여도 계대수가 증가하면 세포주의 특성이 변화하기때문에 효율적인 바이러스 배양을 위해서는 특정한 바이러스에 감수성이 뛰어난 세포를 cloning 하여야 할 것으로 사료가 된다.

 CDV를 배양하기 위하여 MDCK 세포를 Na2 EDDA를 이용하여 MDCK-E와 MDCK-F로 분리하고, MDCK와 비교하여 CDV에 대한 수율을 검사한 결과, MDCK-E에서 가장 높은 결과가 나왔다. 가장CDV의 수율이 좋았던 MDCK-E를 이용하여 최적의 배양조건을 탐색한 결과 100%의 세포단층을 이루었을 때 0.1 MOI로 바이러스를 접종하고, DMEM-C 배지를 추가한 후 CPE가 90% 이상 발생하였을 때 배지를 수거하는 것이었다.

Reference

1.An DJ, Yoon SH, Park JY, No IS, Park BK. Phylogenetic characterization of canine distemper virus isolates from naturally infected dogs and a marten in Korea. Vet Microbiol 2008, 132, 389-395.
2.Bergman JG, Muniz M, Sutton D, Fensome R, Ling F, Paul G. Comparative trial of the canine parvovirus, canine distemper virus and canine adenovirus type 2 fractions of two commercially available modified live vaccines. Vet Rec 2006, 159, 733-736.
3.Bussell RH, Karzon DT. Canine distemper virus in chick embryo cell culture. Plaque assay, growth, and stability. Virology 1962, 18, 589-600.
4.Cornwell HJ, Weir AR, Wright NG, Thompson H. The susceptibility of a dog kidney cell-line (MDCK) to canine distemper, infectious canine hepatitis and canine herpes virus. Res Vet Sci 1970, 11, 580-582.
5.Drewa T, Szmytkowska K, Wlodarczyk Z, Sir I, Kierzenkowska- Mila C. Does the presence of unwanted dermal fibroblasts limit the usefulness of autologous epidermal keratinocyte grafts? Transplant Proc 2006,38, 3088-3091.
6.Hahn W, Kim SH, Lee DS, Yoon BS, Lim YK. Induction of local immunity by intranasal vaccination with live attenuated canine distemper virus in dogs. Kor J Vet Publ Hlth 2000, 24, 147-156.
7.Harrison MJ, Oxer DT, Smith FA. The virus of canine distemper in cell culture. II. Effect of serial passage in ferret kidney cell cultures and BS-C-1 cell cultures on the virulence of canine distemper virus. J Comp Pathol 1968, 78, 133-139.
8.Kasza L. Recovery of canine distemper virus from subcultured primary dog kidney cell culture. Res Vet Sci 1968, 9, 187-188.
9.Lan NT, Yamaguchi R, Kai K, Uchida K, Kato A, Tateyama S. The growth profiles of three types of canine distemper virus on Vero cells expressing canine signaling lymphocyte activation molecule. J Vet Med Sci 2005, 67, 491-495.
10.Lednicky JA, Meehan TP, Kinsel MJ, Dubach J, Hungerford LL, Sarich NA, Witecki KE, Braid MD, Pedrak C, Houde CM. Effective primary isolation of wildtype canine distemper virus in MDCK, MV1 Lu and Vero cells without nucleotide sequence changes within the entire haemagglutinin protein gene and in subgenomic sections of the fusion and phospho protein genes. J Virol Methods 2004, 118, 147-157.
11.Martella V, Elia G, Buonavoglia C. Canine distempervirus. Vet Clin North Am Small Anim Pract 2008, 38, 787-797.
12.Mochizuki M. Growth characteristics of canine pathogenic viruses in MDCK cells cultured in RPMI 1640 medium without animal protein. Vaccine 2006, 24, 1744-1748.
13.Narang HK. Ultrastructural study of long-term canine distemper virus infection in tissue culture cells. Infect Immun 1982, 36, 310-319.
14.Vasioukhin V, Bauer C, Yin M, Fuchs E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell 2002, 100, 209-219.